熊 爽，刘成雁，王志嘉，李 红，任雪冬，王 璐，田福林，赵海波

(辽宁省分析科学研究院 辽宁省标准化体系建设工程技术研究中心，辽宁 沈阳 110015)

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定祛痘类化妆品中保泰松与氨基比林的研究

熊 爽，刘成雁*，王志嘉，李 红，任雪冬，王 璐，田福林，赵海波

(辽宁省分析科学研究院 辽宁省标准化体系建设工程技术研究中心，辽宁 沈阳 110015)

建立了快速测定祛痘类化妆品中保泰松和氨基比林的固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱分析方法。样品以乙腈为提取溶剂超声萃取，经Oasis HLB固相萃取柱净化浓缩后，采用Eclipse XDB-C18(3.5 μm，4.6 mm×150 mm)色谱柱进行分离，甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵溶液为流动相梯度洗脱，流速为0.5 mL·min-1。采用电喷雾正离子源(ESI+)，多反应监测(MRM)扫描方式检测，基质匹配标准曲线法定量。结果表明，保泰松和氨基比林在2.0～200.0 μg·L-1范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.99，方法检出限分别为1.5、0.8 μg·kg-1，定量下限分别为4.9、2.7 μg·kg-1。低、中、高3个加标水平下的平均回收率为77.8%～93.4%，日内相对标准偏差(RSD)为2.4%～7.8%，日间RSD为3.6%～9.5%。该方法简捷、快速、检出限低，能够为化妆品中保泰松和氨基比林残留状况的监测工作和产品质量控制提供科学依据和技术支持。

超高效液相色谱-串联质谱；化妆品；保泰松；氨基比林；固相萃取

近年来化妆品已成为人们生活中的必需品，其安全性问题引起了广泛关注，对其质量的要求也越来越严格。保泰松(Phenylbutazone)属吡唑酮类解热镇痛消炎药，其解热镇痛作用较弱，但消炎作用较强。临床研究表明，保泰松具有一定的祛痘、抗粉刺等功效。该类药物可被添加在祛痘类化妆品中使用，长期接触或摄入这类化妆品，将造成人体多种器官慢性损伤[1]，严重者可引起消化道系统、造血系统、泌尿系统等疾病[2]。为避免含有此类药物的化妆品给消费者带来健康危害，我国2015版《化妆品安全技术规范》中明确规定保泰松为化妆品组分中禁用物质[3]。由于氨基比林(Aminopyrine)与保泰松同属非甾体消炎药，抗菌作用相似，因此将这两种药物作为本文的研究对象。

目前关于化妆品中保泰松残留量测定的国标检测方法尚未制订，相关文献多数报道保泰松的药理作用[4-7]，关于保泰松含量的测定方法主要有薄层色谱法(TLC)[8]、原子荧光分光光度法(AFS)[9]、电致化学发光法(ECL)[10]、高效液相色谱法(HPLC)[11-12]、气相色谱法(GC)[13]及液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[14-18]。其中TLC、AFS、ECL法的检测灵敏度低；HPLC和GC法的选择性和特异性差，易造成假阳性，不能满足检测要求；HPLC-MS/MS法高效快速、灵敏准确，适合于痕量物质的测定分析。但已报道的文献多以中成药、保健食品及动物源性食品为研究对象，关于同时测定化妆品中保泰松和氨基比林的方法尚未见报道。本文采用乙腈为提取溶剂超声萃取，饱和氯化钠溶液分离乳化，Oasis HLB固相萃取柱净化后，利用超高效液相色谱-串联质谱测定样品，并进行了完整的方法学确证,考察了固相萃取条件及样品的基质效应，并采用基质加标法定量消除基质影响。该方法简捷、快速、检出限低、重现性好，能够为化妆品中保泰松和氨基比林残留的监测和产品质量控制提供科学依据，保障化妆品的卫生和安全。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200 UPLC/6410B MS/MS 液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国Agilent公司)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)；Q3200DB型超声清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司)；固相萃取装置(美国Agilent公司)；固相萃取柱：Oasis HLB(500 mg/6 mL)、Oasis MCX(150 mg/6 mL)、C18(500 mg/6 mL)；SBH130D/3型氮吹仪(英国Bibby Stuart公司)；CT14RD型离心机(上海天美科学仪器有限公司)；CPA225D型电子天平(德国Sartorius公司)。

保泰松、氨基比林(纯度≥99.5%，德国Sigma公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)；甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)；乙酸铵、氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液配制与标准曲线

标准储备液：准确称取保泰松和氨基比林各5.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，配制成0.1 mg·mL-1的标准储备液，于-18 ℃冰箱中保存。标准工作溶液：临用时取适量的标准储备液，用甲醇配制成质量浓度分别为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg·L-1的系列标准工作溶液。基质匹配标准混合溶液：取不含待测组分的阴性样品，按“1.3”样品前处理后作为标准溶液的稀释液，配制成不同质量浓度的基质匹配标准混合溶液。

1.3 样品处理

1.3.1 样品提取 准确称取样品0.2 g(精确至0.01 g)，置于50 mL具塞塑料离心管中，加入3 mL饱和氯化钠溶液，充分涡旋混匀1 min，加入7 mL乙腈超声提取15 min，以12 000 r/min高速低温离心10 min，移取上层清液，重复提取1次，合并提取液。

1.3.2 样品净化 依次用5 mL甲醇和10 mL水活化Oasis HLB固相萃取柱，将“1.3.1”中所得提取液过柱，保持重力自流状态，弃去流出液，用5 mL水淋洗固相萃取柱，待液体流尽后，用8 mL甲醇(分2次，每次4 mL)洗脱目标物，收集洗脱液，于40 ℃氮气吹干。样品用1 mL初始比例流动相溶解，过0.2 μm微孔滤膜，经UPLC-MS/MS测定。

1.4 测定方法

1.4.1 液相色谱条件 色谱柱：Eclipse XDB-C18色谱柱(3.5 μm,4.6 mm×150 mm)；流动相：A为10 mmol ·L-1乙酸铵溶液，B为甲醇，梯度洗脱程序：0～4 min,40%～30% A；4～7 min,30%～20%A；7～8 min,20%～40% A；后运行7 min；流速为0.5 mL·min-1；柱温 40 ℃；进样量5 μL。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源，正离子电离模式(ESI+)；干燥气(N2)温度：350 ℃，干燥气流量：9.0 L·min-1，离子源温度：350 ℃，雾化气(N2)压力：295.4 kPa，电喷雾电压：4 000 V，扫描方式为多反应监测(MRM)模式。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

由于保泰松和氨基比林具有碱性基团，容易加合H+形成带正电荷的母离子[M+H]+，因此选用ESI+为离子化模式，确定分子离子峰，并对母离子进行碰撞诱导解离，选择2个信噪比较高的特征子离子分别作为定量、定性离子对，然后对离子源温度、干燥气温度及流量、雾化器压力等参数进行优化，使待测物的离子化效率达到最佳。其质谱参数见表1。

表1 保泰松和氨基比林的质谱条件参数

* quantitative ion

2.2 液相色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择 根据待测组分的结构特点，选择C18反相色谱柱进行分离。实验考察了Eclipse plus-C18分析柱、Eclipse XDB-C18分析柱和Zorbax SB-C18分析柱的分离效果。结果表明：Eclipse XDB-C18分析柱的柱效高且分离效果最好，尤其是在目标化合物低浓度情况下表现尤佳，可能因为Eclipse XDB-C18分析柱为硅醇基双封端，分离胺碱类物质峰形尖锐，适用于偏碱性环境，因此本实验选其作为分析柱。

图1 保泰松(峰2)和氨基比林(峰1)的总离子流图Fig.1 MRM chromatogram of phenylbutazone(2) and amidopyrine(1)

2.2.2 流动相的选择 考察了在甲醇-水、乙腈-水流动相中分别添加0.1%甲酸、10 mmol·L-1乙酸铵时对待测物色谱行为和离子化程度的影响。通过比较发现，在同样的梯度洗脱程序下，使用甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸体系时，氨基比林的峰形不对称且不平滑，保泰松的响应低，峰形宽，且保留时间长，出峰慢；使用乙腈-10 mmol·L-1乙酸铵体系时，氨基比林的峰形尖锐，但保泰松与氨基比林的分离效果差，且其峰形展宽；而使用甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵体系时，可获得最优的分离效果和质谱响应信号，且各色谱峰峰形尖锐，这可能是由于甲醇比乙腈更易给出质子，且乙酸铵体系可改善含碱性基团化合物的色谱峰形。故最终确定以甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵水溶液为流动相体系进行梯度洗脱，此时保泰松和氨基比林可在7 min内获得较好的分离效果(见图1)。

2.3 样品提取方法的优化

为了减少操作步骤，并获得尽可能高的提取效率，分别考察了3种不同种类基质(水剂、乳液、膏霜)中的保泰松和氨基比林以甲醇和乙腈作为提取溶剂以及在不同提取时间(5、10、15、20 min)下的提取效果(见表2)。实验结果表明，乙腈作为提取溶剂、超声提取15 min时的提取效率最高，表明此时待测组分提取完全。

表2 不同超声提取时间对保泰松和氨基比林回收率的影响

图2 不同固相萃取柱对保泰松和氨基比林回收率的影响Fig.2 Effect of different SPE columns on recoveries of phenylbutazone and amidopyrine

2.4 固相萃取条件的优化

2.4.1 固相萃取柱的选择 固相萃取技术(Solid phase extraction，SPE)是化妆品前处理领域应用较为广泛的一种前处理方法。与传统液液萃取相比，SPE克服了有机溶剂消耗大、操作复杂的缺点，且无相分离过程，减少了对环境的污染，具有操作简便、选择性好等优点[19-20]。本实验考察了Oasis HLB(500 mg/6 mL)、Oasis MCX(150 mg/6mL)和C18(500 mg/6 mL) 3种不同类型的固相萃取柱对空白样品加标回收率的影响，结果如图2所示。由图可知，Oasis MCX柱虽然对碱性化合物的选择性高，但由于化妆品中有油脂干扰，净化后氨基比林的响应较低；而Oasis HLB柱的吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，与化合物有多个结合位点，因此与C18柱相比，相对保留容量较高，过柱损失较少，因而保泰松和氨基比林净化后的回收率均较高且净化效果较理想，本实验最终选择Oasis HLB固相萃取柱进行萃取。

2.4.2 洗脱溶剂体积的选择 在加标水平为20 μg·L-1时，考察了洗脱剂甲醇体积分别为2、5、8、10 mL时对提取回收率的影响，每个用量水平重复测定3次。结果表明，随着洗脱溶剂体积的增加，保泰松和氨基比林的回收率明显提高；但当洗脱溶剂体积大于8 mL时，各目标化合物的回收率趋于稳定。因此，最终选择8 mL甲醇作为洗脱溶剂。

2.5 基质效应的考察

基质效应包括绝对基质效应和相对基质效应。不考虑其它因素，绝对基质效应主要影响方法的准确度，相对基质效应主要影响方法的精密度。因此本文采取常用的提取后添加法[21]评价基质效应，即基质效应(ME)为基质匹配标准曲线的斜率与溶剂配制标准曲线的斜率之比，其比值越接近1，说明基质效应越小，反之亦然。由表3结果可见，保泰松和氨基比林均存在不同程度的基质抑制效应，实验采用基质加标法定量，可较好地消除基质效应带来的影响，保证结果的准确性。

2.6 线性范围、检出限与定量下限

取空白基质配制质量浓度分别为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg·L-1的混合标准溶液，以峰面积(y)对质量浓度(x,μg·L-1)绘制标准曲线。结果显示：保泰松和氨基比林在2.0～200.0 μg·L-1范围内呈良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99，分别以3倍信噪比(S/N≥3)及10倍信噪比(S/N≥10)进行计算，得到方法的检出限(LOD)分别为1.5、0.8 μg·kg-1，定量下限(LOQ)分别为4.9、2.7 μg·kg-1(见表3)。

表3 保泰松和氨基比林的线性方程、相关系数、检出限、定量下限及基质效应

2.7 加标回收率、准确度与精密度

在不含待测组分的3种不同种类基质(水剂、乳液、膏霜)的阴性样品中，分别添加5.0、20.0、100.0 μg·L-1的标准混合溶液，进行加标回收率和精密度试验。每个浓度平行测定6次，连续测定3 d，各待测组分的回收率及日内、日间相对标准偏差(RSD)如表4所示。保泰松和氨基比林的平均回收率为77.8%～93.4%，日内RSD为2.4%～7.8%，日间RSD为3.6%～9.5%。方法的准确度与精密度可满足定量分析的要求。

表4 不同种类基质中保泰松和氨基比林的回收率及相对标准偏差

2.8 实际样品的检测

应用本方法对市售的具有抗痘除螨作用的洗面奶、化妆水、乳液、面霜、面膜等不同类型的化妆品样品共20种进行分析测定，均未检出保泰松和氨基比林。

3 结 论

本文建立了超声提取-固相萃取柱净化/超高效液相色谱-串联质谱法同时测定不同种类抗痘化妆品中保泰松和氨基比林的残留量。该方法定性能力强，可排除杂质对目标化合物的影响，具有重现性好、简便快速、灵敏度高等优点，能满足不同类型抗痘化妆品中保泰松和氨基比林的定性和定量分析要求。

[1] Zhu L，Liu Y，Zeng S P，Wang W J，Chen Y F，Yin L H.J.Instrum.Anal.(朱俐，刘洋，曾三平，王伟娇，陈亚飞，尹利辉.分析测试学报)，2016，35(2)：185-193.

[2] Jiang X.J.Pain(蒋夏.疼痛学杂志)，1994，2(2)：79-81.

[3] Ministry of Health of China.Safety and Technical Standards for Cosmetics.Beijing:Ministry of Health of the People's Republic of China(卫生部.化妆品安全技术规范.北京：中华人民共和国卫生部)，2015：77.

[4] Domenjoz R.AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences，2006，86(1)：263-291.

[5] Boison J O，Dowling T，Johnson R，Kinar J.DrugTest.Anal.，2016，8(4)：535-538.

[6] Russeva V，Mihailova D.Arzneimittel-Forschung，1999，49(3)：255-258.

[7] Miura T，Muraoka S，Fujimoto Y.FreeRadic.Res.，2001，34(2)：167-175.

[8] Deng S Y，Ma Q L，Ding Y，Zhu L M.Chin.J.Pharm.Anal.(邓树勇，马启龙，丁燕，朱莉明.药物分析杂志)，2009，29(10)：1719-1721.

[9] Xu Y，Shen H X，Huang H G.Chem.J.Chin.Univ.(徐岩，沈含熙，黄汉国.高等学校化学学报)，1996，17(12)：1855-1858.

[10] Chen Y T，He W W，Lin Q，Lou B Y，Chen G N.ActaChim.Sin.(陈毅挺，何伟文，林棋，娄本勇，陈国南.化学学报)，2009，67(14)：1615-1620.

[11] He R S，Huang Y T，Lei Y，Wang D M.J.Instrum.Anal.(何睿偲，黄艳婷，雷毅，王冬梅.分析测试学报)，2016，35(11)：1486-1490.

[12] Li L，Jiang Y，Chen N H.Chin.Med.Pharm.(李玲，姜燕，陈乃红.中国医药科学)，2015，5(19)：72-74.

[13] Zhang Y，Ouyang X M.Chin.J.Pharm.Anal.(张亿，欧阳晓玫.药物分析杂志)，1995，15(1)：63-64.

[14] Pan W，Gu X R，Liu Z Z，Hu X.Chin.J.Pharm.Anal.(潘炜，顾鑫荣，刘志璋，胡侠.药物分析杂志)，2012，32(2)：261-266.

[15] Hu Q，Cui Y L，Zhang S，Wang K，Ji S.Chin.Tradit.PatentMed.(胡青，崔益泠，张甦，王柯，季申.中成药)，2009，31(10)：1547-1550.

[16] Li J，Shen G F，Zhu J，Qiu Y J.Chin.Tradit.HerbalDrugs(励炯，沈国芳，朱建，裘一婧.中草药)，2014，45(18)：2647-2651.

[17] Zhou J L，Fang C F，Chen Y，Chen B L.Chin.J.Pharm.Anal.(周建良，方翠芬，陈勇，陈碧莲.药物分析杂志)，2013，32(2)：281-285.

[18] Hu T，Peng T，Li X J，Chen D D，Dai H H，Zhou Y N，Xia X，Ding S Y，Zhu A L，Jiang H Y.Chin.J.Anal.Chem.(胡婷，彭涛，李晓娟，陈冬东，代汉慧，周玥宁，夏曦，丁双阳，朱爱玲，江海洋.分析化学)，2012，40(2)：236-242.

[19] Zhang Y S，Lin Z H，Hu Y L，Li G K.J.Instrum.Anal.(张艳树，林振华，胡玉玲，李攻科.分析测试学报)，2016，35(2)：127-135.

[20] Meng X S，Ma Q，Bai H，Li W T，Wang C.J.Instrum.Anal.(孟宪双，马强，白桦，李文涛，王超.分析测试学报)，2016，35(2)：143-155.

[21] Xiang P，Shen M，Zhuo X Y.J.Instrum.Anal.(向平，沈敏，卓先义.分析测试学报)，2009，28(6)：753-756.

Simultaneous Determination of Phenylbutazone and Aminopyrine in Anti-acne Cosmetics by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

XIONG Shuang，LIU Cheng-yan*，WANG Zhi-jia，LI Hong，REN Xue-dong，WANG Lu,TIAN Fu-lin，ZHAO Hai-bo

(The Standard Engineer Research Center of Liaoning Province,Liaoning Academy of Analytical Science，Shenyang 110015,China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method with solid phase extraction(SPE) was applied in the simultaneous determination of phenylbutazone and aminopyrine in anti-acne cosmetics.The sample was ultrasonically extracted with acetonitrile,and then purified on an Oasis HLB solid phase extraction column.The separation was performed with an Eclipse XDB-C18(3.5 μm，4.6 mm×150 mm) column,using a mixture of methanol and 10 mmol·L-1ammonium acetate as mobile phase by gradient elution at a flow rate of 0.5 mL·min-1.The analytes were detected with electrospray ionization source in positive ion mode(ESI+) and multiple reaction monitoring(MRM),and quantified by matrix standard curve.The calibration curves of phenylbutazone and aminopyrine were linear in the range of 2.0-200.0 μg·L-1with correlation coefficients(r2) larger than 0.99.The limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) of the method were 1.5,0.8 μg·kg-1and 4.9,2.7 μg·kg-1,respectively.The recoveries of phenylbutazone and aminopyrine were in the range of 77.8%-93.4%at three spiked levels,with intra-day and inter-day relative standard deviations(RSD) of 2.4%-7.8% and 3.6%-9.5%,respectively.With fast detection,high sensitivity and low detection limit,the method is able to provide a scientific basis and a technical support for monitoring residues of phenylbutazone and aminopyrine in cosmetics and product quality control.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);cosmetics;phenylbutazone;aminopyrine;solid phase extraction(SPE)

2017-03-03；

2017-03-28

国家重大科学仪器设备开发专项资助(2012YQ1200440602)；辽宁省科学事业公益研究基金项目资助(2014002001)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.006

O657.63；TQ460.72

A

1004-4957(2017)08-0980-06

*通讯作者：刘成雁，博士，教授，研究方向：危险化学品的快速分析方法和应急处理，Tel:024-24822348，E-mail:chengyanliuln@163.com