刘永强,刘 胜,许文娟,李 凯,张 靖,孙 军

(1.潍坊出入境检验检疫局 技术中心,山东 潍坊 261041；2.淄博出入境检验检疫局 技术中心,山东 淄博 255035)

QuEChERS/超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法同时测定小麦粉中17种农药残留

刘永强1*,刘 胜2,许文娟1,李 凯1,张 靖1,孙 军1

(1.潍坊出入境检验检疫局 技术中心,山东 潍坊 261041；2.淄博出入境检验检疫局 技术中心,山东 淄博 255035)

建立了超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)同时测定小麦粉中17种农药残留的检测方法。样品采用QuEChERS方法进行前处理,以0.1%(体积分数)乙酸乙腈溶液提取,PSA和C18吸附剂净化,电喷雾正离子模式检测,外标法定量,同时建立了包含一级精确质量和二级碎片离子信息的筛查确证谱库。在各自的线性范围内,17种化合物的线性关系良好,相关系数均大于0.995。方法的定量下限为5.0～10.0 μg/kg,3个加标水平下的回收率为70.3%～114.9%,相对标准偏差(RSD,n=6)为0.4%～11.7%。该方法操作简便、稳定性好,具有较强的实际应用价值。

超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱；农药残留；小麦粉；QuEChERS

现代农业中农药的广泛使用导致其残留问题日趋显现,对国民健康和生态环境造成了巨大影响,因此各国政府和相关国际组织对农药残留极为重视。例如中国在《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》(GB 2763-2016)[1]中规定了433种农药4140项最大残留限量；欧盟、美国、日本等地区和国家也制订了各类食品中多种农药的最大残留限量。为了保证国内和出口农产品的安全,需建立农药多残留的快速筛查方法。

目前小麦粉中农药多残留的检测方法主要包括气相色谱法(GC)[2]、液相色谱法(LC)[3-4]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[5]和液相色谱-串联四极杆质谱法(LC-MS/MS)[6-7]。其中GC和LC的定性能力较弱,而GC-MS和LC-MS/MS则均为低分辨质谱。近年来,高分辨质谱以其高质量精度、高分辨率和高通量分析的优势[8-9]在农药多残留筛查检测中的应用逐渐增多[10-13],庞国芳院士等在此领域做了较多研究[14-17],但利用高分辨质谱进行粮谷中农药多残留筛查检测的研究鲜有报道。

本文基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)技术,采用QuEChERS前处理技术,通过优化实验条件和仪器参数,建立了小麦粉中17种农药残留的筛查分析方法,同时建立了包含保留时间、精确质量数和4个碰撞能量(10、20、30、40 eV)下碎片离子质谱图信息的筛查谱库。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1290-6530超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪(安捷伦科技公司,美国)；5810R高速冷冻离心机(Eppendorf公司,德国)；R-210旋转蒸发仪(Buchi公司,瑞士)；T25均质器和MS3涡流混匀器(IKA公司,德国)；XS203S电子天平(Metler Toledo公司,瑞士)；Reference A10超纯水机(Millipore公司,美国)。

17种农药标准品(纯度:95.1%～99.7%,Dr.Ehrenstorfer公司,德国)；乙腈(色谱纯,Fisher公司,美国)、甲醇(色谱纯,Merck公司,美国)；无水乙酸钠(分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司)；吸附剂PSA(N-丙基乙二胺)、C18(十八烷基键合硅胶)(天津博纳艾杰尔公司)。

1.2 样品提取与净化

提取:称取小麦粉样品3 g(精确至0.01 g),置于100 mL塑料离心管中,加入1.5 g无水乙酸钠,15 mL 0.1%(体积分数)乙酸乙腈溶液,11 000 r/min均质提取2 min,以10 000 r/min离心10 min,移取上层提取液10 mL(相当于2.0 g样品)于250 mL尖底旋蒸瓶中,40 ℃水浴旋转浓缩至近干,用乙腈涡混溶解残渣并定容至2.0 mL,待净化。

净化:分别称取150 mg C18、150 mg PSA置于10 mL塑料离心管中,将上述2 mL溶解液转入该离心管,涡混2 min,5 000 r/min离心3 min,取1 mL上清液于玻璃离心管中,用氮气吹干,0.1%甲酸水-乙腈(9∶1,体积比)定容至1 mL,过0.45 μm滤膜,供分析。

1.3 仪器条件

液相色谱条件:色谱柱:Agilent Poroshell 120 SB-C18柱(3.0 mm×100 mm,2.7 μm)。流动相:A为0.1%甲酸水(含5 mmol/L乙酸铵),B为乙腈。梯度洗脱程序:0～5.00 min,1%～40%B；5.00～8.00 min,40%B；8.00～14.00 min,40%～60%B；14.00～18.00 min,60%～90%B；18.00～18.01 min,90%～1%B；18.01～20.50 min,1%B。流速:0.4 mL/min；柱温:40 ℃；进样量:10 μL。

质谱条件:离子源:ESI。扫描方式:正离子扫描。扫描范围:m/z100～1 000。干燥气温度:325 ℃；干燥气流速:10 L/min；雾化器压力:276 kPa；鞘气温度:350 ℃；鞘气流速:12 L/min；喷嘴电压:0 V；参比离子为m/z121.050 9，922.009 8,用于实时校正；Targeted MS/MS模式下采集二级质谱数据,在Targeted List Table中设置以下参数:母离子、母离子的电荷状态(Z,1)、保留时间、保留时间偏差(0.5 min)、四极杆分辨率[Isolation Width,Narrow(～1.3m/z)]和碰撞能量。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理优化

2.1.1 提取条件的优化 考察了农残检测中常用试剂乙酸乙酯、丙酮、乙腈和0.1%乙酸乙腈的提取效果,4种提取液均为澄清状态,无明显差别。从实验结果看,乙酸乙酯、丙酮、乙腈和0.1%乙酸乙腈对17种目标物的平均回收率分别为43.2%、51.7%、64.3%和81.5%,以0.1%乙酸乙腈的提取效率最高。在此基础上考察了不同体积提取试剂(5、10、15、20、25 mL)的影响,结果发现,当提取试剂的体积小于15 mL时,目标物的平均回收率随提取试剂体积的增加而提高,提取试剂的体积大于15 mL时,回收率无明显提高。考虑到提取试剂体积越大,样品中的干扰物被提取出的几率越大,所以选用提取试剂0.1%乙酸乙腈的体积为15 mL。

目前农残检测中多采用均质提取方式,相比于其它方式,均质提取可以有效破坏样品组织细胞,保证提取试剂和样品的充分接触,且在高速均质过程中释放出较多热量也有利于农药残留的提取,因此本实验选择均质提取。

采用QuEChERS前处理方法检测干性植物源性样品的农药残留时,检测前样品需加入适量的水浸泡[18]。本实验对比了未加水浸泡提取和加水浸泡提取两种方式对回收率的影响。结果表明,除噻虫嗪、甲萘威和咪鲜胺外,未加水浸泡提取目标物的回收率高于加水浸泡提取,且加水浸泡后的小麦粉极易结块粘结在均质机刀头上,难以操作。因此本实验选择未加水浸泡提取方式。

2.1.2 净化条件的优化 对于植物源性样品,常用的净化吸附剂有PSA、C18和GCB,PSA对各种有机酸、色素和部分糖和脂肪的去除比较有效；C18主要用于去除非极性杂质；GCB是去除色素的首选,但其对部分农药的吸附较强。考虑到小麦粉样品中色素较少,选用了PSA和C18两种吸附剂进行优化,固定PSA和C18用量均为200 mg,比较两种吸附剂单独使用和混合使用的实验效果。结果表明,PSA和C18单独使用时17种目标物的平均回收率分别为60.3%和72.7%,两者混合使用时回收率为83.2%。当PSA和C18分别为100、150、200、300 mg时,考察了两两组合时17种目标化合物的回收率,结果表明,当PSA和C18均为150 mg时,净化效果最好,94.1%的目标化合物回收率为70%～120%。因此最终确定PSA和C18两种吸附剂的用量均为150 mg。

2.2 仪器参数的优化

离子源参数的设置会直接影响质谱仪器分析的灵敏度和稳定性,对于实验所用的ESI源而言,鞘气温度、鞘气流速和喷嘴电压3个参数对目标化合物测定有较大影响。分别设定喷嘴电压为0、125、250、500 V,以17种目标物的峰面积来衡量色谱峰的信号强度,结果表明,17种目标物均在喷嘴电压为0时响应值最高。分别将鞘气温度和鞘气流速设定为300、325、350 ℃和10、11、12 L/min,两两组合,结果表明,除甲硫威外,其余化合物均在鞘气温度和鞘气流速为350 ℃和12 L/min时响应值较高。综上,鞘气温度、鞘气流速和喷嘴电压分别设定为350 ℃、12 L/min和0 V。

2.3 谱库的建立

建立筛查谱库分为两步:首先,在全扫描模式(MS mode)下对17种农药的混标进行测定,各目标物的提取离子色谱图见图1；第二步,在目标MS/MS模式(Targeted MS/MS mode)下进行采集,得到不同碰撞能量下碎片离子的质谱图。表1列出了17种农药的分子式、理论分子量、保留时间、母离子、CAS号和碰撞能量为20 eV时相对丰度最高的2个质谱碎片离子等信息。

表1 17种农药的分子式、理论分子量、保留时间、母离子、CAS号及碎片离子信息

(续表1)

No．PesticidecompoundMolecularformulaTheoreticalmassRetentiontime(min)Precursor(m/z)CASnumberFragmentationions(m/z)10Imidacloprid(吡虫啉)C9H10ClN5O2255 05435 196256 0597105827-78-9175 0928，209 059511Acetamiprid(啶虫脒)C10H11ClN4222 06865 547223 0745135410-20-7126 0105，56 049412Phosphamidon(磷胺)C10H19ClNO5P299 07076 293300 076513171-21-6127 0154，174 067813Carbofuran(克百威)C12H15NO3221 10657 373222 11251563-66-2123 0433，165 091414Carbaryl(甲萘威)C12H11NO2201 08027 852202 086363-25-2145 0647，127 054215Metalaxyl(甲霜灵)C15H21NO4279 14868 486280 154457837-19-1192 1382，160 112016Methiocarb(甲硫威)C11H15NO2S225 083910 958226 08912032-65-7122 0689，166 064117Prochloraz(咪鲜胺)C15H16Cl3N3O2375 032714 610376 038367747-09-5308 0010，309 9981

图1 17种农药的提取离子色谱图

Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 17 pesticides

2.4 定性筛查及确证

应用建立的谱库进行检索时,化合物的精确质量数偏差、保留时间偏差、同位素分布和同位素丰度比是影响定性判定的主要因素,将通过定性筛查出的疑似阳性化合物在目标MS/MS模式(Targeted MS/MS mode)下进行确证。根据欧盟SANTE/11945/2015[19],使用高分辨质谱确证时,至少需1个精确质量数的母离子和1个碎片离子。因此,应用本文建立的谱库,17种目标化合物均能被准确确证。以甲萘威为例,列出了定性确证的谱图信息,见图2。

2.5 方法学考察

取空白小麦粉样品,按“1.2”方法处理后,得到空白样品提取液,用其稀释混标溶液配制成系列基质标准溶液,在建立的仪器条件下测定,以峰面积(Y)对质量浓度(X)作标准曲线,以10倍信噪比(S/N=10)计算定量下限(LOQ)。在测定不含待测目标物的小麦粉样品中进行3个加标水平(LOQ、2LOQ和5LOQ)的回收率和精密度实验,每个加标水平做6个平行。17种目标化合物的线性范围、线性方程、相关系数(r)、LOQ、回收率及相对标准偏差(RSD)见表2。17种目标化合物在线性范围内相关系数均大于0.995,LOQ为5.0～10.0 μg/kg,3个加标水平下的回收率为70.3%～114.9%,RSD不大于11.7%,方法精密度好,回收率高,能够满足日常检测的需求。

图2 小麦粉中甲萘威的定性确证信息

表2 17种农药的线性范围、线性方程、相关系数(r)、定量下限(LOQ)、回收率和相对标准偏差(n=6)

number(1-17) denoted was the same as that in Table 1

2.6 实际样品检测

利用本实验建立的方法对市场上购买的20份小麦粉样品进行检测,测出阴性样品8份,阳性样品12份,其中5份检出吡虫啉,3份检出啶虫脒,2份检出克百威和啶虫脒,1份检出多菌灵和吡虫啉,1份检出吡虫啉和啶虫脒。所检出的吡虫啉含量为0.007～0.021 mg/kg,啶虫脒含量为0.011～0.092 mg/kg,克百威含量分别为0.031 mg/kg和0.052 mg/kg,多菌灵含量为0.019 mg/kg,均未超出GB 2763-2014[20]所规定的最大残留限量。

3 结 论

本研究建立了适用于小麦粉中17种农药残留的超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱筛查确证方法。该方法高效简便,回收率、重现性和检出限等指标完全满足日常检测的要求,可同时对样品中的目标物进行筛查和确证,为快速检测小麦粉中的农药残留提供了科学参考。

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[20] GB 2763-2014.National Food Safety Standard-Maximum Residue Limits for Pesticides in Food. National Standards of the People’s Repubic of China(食品安全国家标准-食品中农药最大残留限量.中华人民共和国国家标准).

Simultaneous Determination of 17 Pesticide Residues in Flour by QuEChERS/Ultra Performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometry

LIU Yong-qiang1*,LIU Sheng2,XU Wen-juan1,LI Kai1,ZHANG Jing1,SUN Jun1

(1.Inspection and Quarantine Technology Center,Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Weifang 261041,China；2.Inspection and Quarantine Technology Center,Zibo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Zibo 255035,China)

An analytical method was established for the simultaneous determination of 17 pesticide residues in flour by ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF/MS).The QuEChERS method was validated for the extraction.In this method,the samples were extracted with 0.1%(by volume)acetic acid-acetonitrile solution,and cleaned-up by PSA and C18adsorbents,then determined by UPLC-Q-TOF/MS with electrospray ionization in positive mode.The quantification analysis was performed by the external standard calibration.A database including accurate mass and fragment ions information was established.The correlation coefficients(r)were more than 0.995 in the linear range of the 17 pesticides.The limits of quantitation(LOQs)of the method were in the range of 5.0-10.0 μg/kg.The recoveries at three spiked levels were between 70.3%and 114.9%with relative standard deviations(RSDs,n=6)of 0.4%- 11.7%.With the advantages of simplicity and good stability,the method is available for practical application.

ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF/MS)；pesticide residues；flour；QuEChERS

2017-04-27；

2017-06-21

山东出入境检验检疫局科研课题(SK201613)；国家质检总局科技计划项目(2016IK202)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.007

O657.63；F767.2

A

1004-4957(2017)08-0986-06

*通讯作者：刘永强,硕士,高级工程师,研究方向:食品中农兽药残留检测,Tel:0536-8582596,E-mail:liuyongqianga@163.com