熊永爱，李文美，吕佳佳，陈莉，欧水平，王森＊＊

苗药鼻宁喷雾剂治疗过敏性鼻炎药效物质研究＊

熊永爱1，李文美1，吕佳佳1，陈莉1，欧水平2，王森1＊＊

（1.遵义医学院遵义563000；2.遵义医学院附属医院遵义563003）

目的：研究苗药鼻宁喷雾剂治疗过敏性鼻炎的药效物质基础，为其质量标准的提升奠定基础。方法：称取处方量的一枝黄花饮片、鹅不食草饮片加水浸泡，进行回流提取，提取液分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得各部位分别干燥后制备成实验用样品溶液。选取健康成年SD大鼠60只，雌雄各半，按体重随机分为6组，每组10只，分别为正常组（Normal）、模型组（Model）、石油醚组（SYM）、乙酸乙酯组（YSYZ）、正丁醇组（ZDC）、水部位组（Water）。除正常组大鼠外其余组大鼠分别用20%二甲苯橄榄油溶液进行造模，造模成功后各给药组滴鼻给药，正常组和模型组滴予生理盐水。实验结束采集各实验组大鼠血清，ELISA法测定大鼠血清中IgE、IL-4和HT的含量，并对鼻粘膜组织病理形态学进行分析。结果：与正常组对照比较，模型组大鼠血清IgE、IL-4和HT含量均有显著增加（P＜0.05）；与模型组对照比较，水部位组大鼠IgE、IL-4和HT含量均有显著降低（P＜0.05），其余各组IgE、IL-4和HT的含量表现出降低趋势，但无统计学意义。鼻黏膜组织病理检查结果显示，与正常组对照比较，模型组大鼠鼻粘膜组织病理损伤指数极显著增大（P＜0.01）；与模型组比较，正丁醇部位组与水部位组大鼠鼻粘膜组织病理损伤指数显著减少（P＜0.05），其余组无统计学意义。结论：鼻宁喷雾剂治疗过敏性鼻炎时的药效物质基础主要是水部位组分。

鼻宁喷雾剂过敏性鼻炎药效物质水部位

苗药鼻宁喷雾剂在临床上治疗过敏性鼻炎，疗效确切。该处方主要是由一枝黄花与鹅不食草精制而成。鹅不食草别名地胡菽，又名通天窍，味辛、性温，属传统解表类中药，其化学成分主要为挥发油、甾醇类、黄酮类、三萜类化合物等[1]。鹅不食草的药理作用十分广泛，具有抗炎、抗癌、抗过敏、抗肿瘤、抗诱变等疗效。近年来，国内外许多学者运用鹅不食草治疗过敏性鼻炎上取得了大量的经验，例如有学者研究鹅不食草软膏、浸液可治疗过敏性鼻炎[2]。其黄酮类、挥发油、伪愈创木内酯类成分所具有的抗过敏、抗炎作用是其治疗鼻炎的药理学基础，但目前其作用机制及药效物质基础仍未明确。

一枝黄花主要含有黄酮、皂苷、苯丙酸、炔属化合物等[3]。一枝黄花的资源丰富，临床应用广泛。具有解毒消肿、疏风清热的功效，主要用于治疗风热感冒、咽喉肿痛、毒虫叮咬、跌打损伤等[5]。现代药理学研究表明，一枝黄花具有抗菌、祛痰平喘以及利尿的作用。近年来，国内开始重视对一枝黄花药理活性的研究，主要致力于开发出新产品，实现其临床应用价值。

过敏性鼻炎（Allergic rhinitis，AR），是临床常见的鼻科病。该病为I型变态反应性疾病，主要病症包括鼻塞、水样鼻涕、鼻黏膜肿胀等。长久的鼻炎症状还会引起鼻腔嗅觉减退、引起呼吸障碍，血氧浓度降低等症状，进一步影响机体的其他组织器官的功能与代谢，引起其他的并发症。其发病机制主要是：变应原进入气管和鼻腔后，刺激T淋巴细胞，使其分化为Th1、Th2类淋巴细胞，其中Th2细胞分泌IL-4、IL-5等细胞因子而辅助B淋巴细胞分化为浆细胞，再由浆细胞分泌合成IgE抗体，IgE抗体与肥大细胞结合，当机体再次接触变应原后，肥大细胞就释放组胺，组胺会引起过敏反应[6]。

处方是中医药临床辨证施治的智慧结晶，同时也是中成药二次开发的基础。明确其药效物质基础及药理作用机制，是中药现代化的重要保障。因此，我们有必要对鼻宁喷雾剂治疗过敏性鼻炎的药效物质进行筛选，以便明晰其药效物质，从而为患者提供更有效的药物治疗基础，改善患者生活质量。同时，也为其质控水平的提升和临床适应症的拓展奠定基础，增强市场竞争力，满足不断发展的临床用药需求以及产品可持续化发展的要求。

1 实验材料

1.1 仪器与试剂

一支黄花饮片（贵州百花药业股份有限公司，批号：160509），鹅不食草饮片（贵州百花药业股份有限公司提供，批号：160721），大鼠IgE（批号：EK-R31200）、IL-4（批号：EK-R30199）、HT（批号：EK-R30185）及ELISA试剂盒均购自欣博盛生物科技有限公司。

1.2 实验动物

SD大鼠60只（许可证号：SCXK（渝）2010-0005），购自第三军医大学。

2 方法与步骤

2.1 药材提取液的制备

依照鼻宁喷雾剂的生产工艺，称取处方量一枝黄花饮片250 g，鹅不食草饮片60 g，加入处方两倍量的蒸馏水浸泡2 h，用蒸馏装置进行回流提取，直到收集处方3倍量的芳香水为止，药渣加水煎煮3次，第一次加入处方6倍量水煎煮2 h，第二次加入处方5倍量水煎煮1.5 h，第三次加入处方4倍量水煎煮1.5 h。合并煎液并过滤，浓缩至相对密度1.15（60℃），加入乙醇使含醇量达70%并搅匀，冷藏24 h，取上清液并回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20（60℃）的浸膏。浸膏先后用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别收集各有机层和水层溶剂，干燥。

2.2 样品溶液的配制

按照鼻宁喷雾剂的临床用药剂量计算出以上样品对于大鼠的给药量，按配比配制成一定浓度的溶液。称取石油醚部位组分溶于70%的聚乙二醇水溶液中配制成浓度为0.12 mg·mL-1的溶液，乙酸乙酯萃取的干燥物溶于聚乙二醇配制成浓度为0.6 mg·mL-1的溶液、同法配制正丁醇部位组分为0.6 mg·mL-1的水溶液、水部位组分配制成8.25 mg·mL-1的水溶液，以上样品溶液分别低温保存备用。

2.3 动物分组、造模及给药

将60只大鼠随机分为6组，每组10只。分别为石油醚组（SYM）、乙酸乙酯组（YSYZ）、正丁醇组（ZDC）、水部位组（Water）、模型组（Model）和正常组（Nor⁃mal）。除正常组外其余每组大鼠分别滴鼻给20%二甲苯橄榄油溶液20µL，每侧鼻孔10µL，1次/天，连续7天，7天后改为隔日滴鼻一次维持致敏状态，直到给药实验结束。而正常组不作任何处理[8]。将上述制备的样品溶液按相应的组分别对大鼠进行给药，给药方法为1次/天，每侧鼻孔10µL，连续用药15天[9]。正常组与模型组给予同剂量的生理盐水。

2.4 血清与组织收集与处理

于最后一次给药后2 h，每组大鼠进行股动脉取血，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，置-20℃保存待分析。大鼠断颈处死后剖取两侧的鼻粘膜组织，去皮后浸泡在甲醛溶液中，置-20℃保存待测。

3 结果

3.1 大鼠血清中IgE的含量测定

按照免疫酶联法（ELISA）操作方法对大鼠血清标本进行测定[10]，计算出IgE含量。如图1所示，与正常组相比，模型组大鼠血清IgE含量显著增多（P＜0.05）；与模型组对照比较，水部位组大鼠血清IgE含量显著降低（P＜0.05），其余各组大鼠血清IgE含量仅有降低趋势，无统计学差异。该结果表明水部位组分可降低过敏性鼻炎大鼠血清中IgE含量。

3.2 大鼠血清中IL-4的含量测定

按照免疫酶联法（ELISA）操作方法对大鼠血清标本进行测定[11]，进而得出IL-4含量。如图2，与正常组相比，模型组大鼠血清IL-4的含量显著增加（P＜0.05），其余组仅有增多趋势；与模型组对照比较，水部位组大鼠血清IL-4含量显著降低（P＜0.05），其余各组大鼠血清IL-4含量仅有降低趋势。该结果显示，水部位组分具有较好的降低过敏性鼻炎大鼠血清中IL-4含量的作用。

图1 大鼠血清中IgE含量（n=10）

图2 大鼠血清中IL-4的含量

图3 大鼠血清中HT的含量

3.3 大鼠血清中HT的含量

图4 大鼠鼻黏膜组织的病理切片

严格按照免疫酶联法（ELISA）操作方法对大鼠血清HT进行测定[12]。结果见图3，与正常组相比，模型组大鼠血清HT的含量显著增多（P＜0.05），其余组仅有增多趋势；与模型组对照比较，水部位组大鼠血清HT含量显著降低（P＜0.05），其余各组大鼠血清HT含量仅有降低趋势，该结果显示，水部位组分具有较好的降低过敏性鼻炎大鼠血清中HT含量的作用。

3.4 大鼠鼻黏膜组织的病理检查

图4结果显示模型组鼻粘膜组织粘膜上皮和固有层排列、分界清晰，粘膜层和粘膜下层分界不清，粘膜层显著增厚，粘膜上皮细胞脱落，或溃烂，粘膜层和粘膜下层大量的炎细胞浸润，其中包括较多的淋巴细胞和中性粒细胞。石油醚部位组大鼠鼻粘膜上皮细胞脱落仍然严重，粘膜层和粘膜下层炎细胞较多；乙酸乙酯部位组大鼠鼻粘膜上皮细胞溃烂、脱落较石油醚组有所减轻，粘膜层和粘膜下层炎细胞开始减少；正丁醇部位组大鼠鼻粘膜上皮细胞溃烂、脱落较石油醚组开始明显减轻，粘膜层和粘膜下层炎细胞明显减少，炎性反应明显减轻。而水部位组大鼠鼻粘膜组织粘膜上皮和固有层排列、分界清晰，纤毛上皮排列整齐，偶见有个别组织内可见炎细胞浸润，恢复良好。由表1可知，与正常组对照比较，模型组大鼠鼻粘膜组织病理损伤指数极显著增大（P＜0.01）；与模型组比较，水部位组大鼠鼻粘膜组织病理损伤指数显著减少（P＜0.05），其余组无统计学意义。

4 讨论

过敏性鼻炎在传统医学中属“鼻鼽”范畴。我国历代医家对于鼻鼽均有阐述，在病因病机上多认为其因脏腑亏虚，风寒外袭所致。对其发病机制的阐释为：肺气虚弱，卫表不固，风寒乘虚而入，犯及鼻窍，邪正相搏，肺气不得通调，津水停聚，鼻窍壅塞，遂致喷嚏、流清涕。临床以鼻痒、打喷嚏、流清涕、鼻塞为主要症状[13]。而现代医学认为过敏性鼻炎是由IgE介导通过释放组织胺或其它化学活性物质诱发的鼻黏膜I型变态反应，属于鼻腔粘膜的变应性疾病。变应原经抗原呈递细胞与肥大细胞表面的IgE抗体结合，肥大细胞脱颗粒，释放炎性反应介质如组胺、激肽、白细胞三烯、前列腺素、嗜酸细胞趋化因子、血小板活化因子、五羟色胺等生物活性介质，从而导致患者出现变态反应症状[14]。

过敏性鼻炎是主要由IgE介导的变态反应性炎症。多种因素（主要是IL-4/IL-13）参与IgE合成的调细胞表面高亲和力受体结合可诱发释放多种炎性介质，在过敏性鼻炎中起重要作用[15]。体内IgE水平的增节，IgE与其受体（FcεR-Ⅰ、FcεR-Ⅱ）也存在复杂的相互作用。IgE与肥大细胞、嗜碱粒细胞及嗜酸粒高往往可以反映过敏性鼻炎特应症（个体对环境中常见的过敏原具有产生IgE抗体的遗传易感性。IgE水平的高低和特应症的严重程度呈正相关[16]。

本实验研究结果表明，鼻灵喷雾剂治疗过敏性鼻炎的物质基础在于水部位，即水溶性有效组分。其机制可能是通过降低AR大鼠血清的IgE、IL-4和HT浓度，降低鼻黏膜嗜酸性粒细胞数，抑制炎性介质的释放，减少炎症细胞在鼻黏膜的聚集，从而减轻鼻道的变态反应。课题组下一步将对该部位有效组分进行指纹图谱分析和有效成分指认，为该制剂的质量标准提升提供依据。

1林远灿,高明.鹅不食草的化学成分及药理研究进展.浙江中医药大学学报,2011,35(2):303-304.

2张舒娜,张亚玉.鹅不食草的临床应用及药理研究进展.吉林农业, 2015,5(19):76-77.

3吴娜,梅艳等.入侵植物加拿大一枝黄花的化学成分及其生物活性综述.浙江农业科学,2016,44(5):5-7.

4温强蔚,祡川,崔小兵,等.加拿大一枝黄花的研究进展.中国名族民间医药,2012,12(2):51-53.

5李晓岚,裘名宜,刘素鹏,等.一枝黄花的化学成分、药理活性及临床应用.时针国医国药,2008,19(1):93-94.

6王敏,张伟.过敏性鼻炎及过敏与原免疫治疗机制的研究进展.中国免疫学杂志,2010,26(12):1137-1140.

7成洪淑,余美荣.鹅不食草提层成分对人鼻咽癌细胞CNE-2生长抑制作用的实验研究.中华中医药学刊,2011,29(7):2-3.

8佟雷,刘金丽,高月娟,等.玉屏风颗粒对过敏性鼻炎大鼠免疫因子的影响.中国中药杂志.2016,41(4):728-730.

9袁颖,郭忻,潘颖宜.鼻炎喷雾剂对变应性鼻炎模型大鼠的药效学研究.南京中医药大学学报,2006,22(1):61-63.

10闫津津,冯珍如,郑新芝,等.变应性鼻炎患者血清抗交叉反应性糖类决定簇IgE水平与血清IgE水平和皮肤点刺试验的关联性分析.中国全科医学,2016,7(21):2499-2504.

11童铁钢,白宇.检测马白细胞介素-18双抗夹心法ELLSA方法的建立.细胞与分子免疫学杂志,2008,14(4):364-368.

12杨军,邓秋,周芸,等.实验性变应性鼻炎中鼻黏膜组胺的测定.首都医科大学学报,2006,27(1):110-111.

13胡瑶,陈旭青,严道南,等.基于“三因制宜”探析过敏性鼻炎治未病理念.中华中医药杂志,2017,6(1):77-79.

14王敏,张伟,张罗,等.过敏性鼻炎及过敏原免疫治疗机制的研究进展.中国免疫学杂志,2010,26(12):1137-1140.

15 Schroeder J T,Bieneman A P,Xiao H,et al.TLR9-and Fcepsi lonRI-me⁃diated responses oppose one another in plasmacytoid dendritic cells by down-regulating receptor expression.J Immunol,2005,175(19):5724-5731.

16 Schroeder J T,Chichester K L,Bieneman A P,et al.Toll-like receptor 9 suppression in plasmacytoid dendrit ic cells after IgE-dependent acti⁃vation is mediated by autocrine TNF-α.J Allergy Clin Immunol,2008, 121(12):486-491.

Study on Material Basis of Miao Medicine Bi-Ning Spray inAllergic Rhinitis Treatment

Xiong Yong’ai1,Li Wenmei1,Lv Jiajia1,Chen Li1,Ou Shuiping2,Wang Sen1
(1.Zunyi Medical University,Zunyi 563000,China; 2.Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi 563003,China)

This paper was aimed to study the material basis for the efficacy of Miao medicine Bi-Ning spray in the treatment of allergic rhinitis,and to lay a foundation for improvement of its quality standard.Solidago and Centipeda minima were weighed according to the prescription and then soaked in water.Reflux extraction was conducted to the liquid.Petroleum ether,ethyl acetate,and n-butanol were used in the extraction,respectively.Each

composition was dried and made into sample solution for the experiment.A total of 60 healthy adult SD rats,with the ratio of half male and half female,were selected and randomly divided into 6 groups according to the weight with 10 rats in each group. There were the normal group,the model group,the petroleum ether(SYM)group,the ethyl acetate(YSYZ)group,the nbutyl alcohol(ZDC)group and the water group.The 20%xylene olive oil solution was used in the model establishment of rats from different groups except the normal group.Intranasal administration of drug was given to different dosage group after the models were successfully established.Normal saline was given to the normal group and the model group.Serum of each experimental rat was collected at the end of the experiment.The contents of IgE,IL-4 and HT in serum were detected by ELISA.The pathological morphology of the nasal mucosa was analyzed.The results showed that compared with the normal group,the contents of IgE,IL-4 and HT in serum of the model group increased significantly(P＜0.05). Compared to the model group,the contents of IgE,IL-4 and HT in serum of the water group decreased significantly(P＜0.05).Contents of IgE,IL-4 and HT in other groups presented decreasing tendency.However,there was no statistical significance.The pathological morphology of the nasal mucosa results showed that compared with the normal group,the cell inflammatory response of the nasal mucosa tissues significantly increased in the model group(P＜0.01).Compared with the model group,the cell inflammatory response of nasal mucosa tissues significantly decreased in the ZDC group and water group(P＜0.05).There was no statistical significance in other groups.It was concluded that components in water part were the main material basis for efficacy of Bi-Ning spray in the treatment of allergic rhinitis.

Bi-Ning spray,allergic rhinitis,medicinal substances,water part

10.11842/wst.2017.05.029

R96

A

（责任编辑：陈宁，责任译审：王晶）

2017-04-19

修回日期：2017-05-18

＊贵州省科技厅贵州省科技支撑计划项目（黔科合SY字[2015]3034）：苗药鼻宁喷雾剂的技术提升与深度开发研究；负责人：王森；遵义市科技局遵义市“15851人才精英工程”项目：苗药鼻宁喷雾剂的技术提升与深度开发研究，负责人：王森。

＊＊通讯作者：王森，副教授，硕士生导师，主要研究方向：经皮给药制剂。