田晨，赵宗江，张丰丰，张新雪，程明秀，王颖超，赵敬，杨美娟

益髓生血颗粒对AA大鼠CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞的影响＊

田晨，赵宗江＊＊，张丰丰，张新雪，程明秀，王颖超，赵敬，杨美娟

（北京中医药大学中医学院北京100029）

目的：观察益髓生血颗粒对再生障碍性贫血（Aplastic Anemia，AA）大鼠CD4+CD25+调节性T细胞（Regulatory T Cell，Treg细胞）的影响及其治疗AA的作用机制。方法：取雄性SD大鼠按体重随机分组。其中模型组连续7周隔天皮下注射苯（1 mL·kg-1）、取材10天前开始腹腔注射环磷酰胺（25 mL·kg-1），连续3天，第4周将模型组大鼠按体重随机分为模型组、司坦唑醇组、益髓生血颗粒组，灌胃给药。正常组及模型对照组给予等体积生理盐水。实验结束时，检测外周血WBC、RBC、HGB、PLT；制备血涂片、骨髓涂片；免疫组织化学法检测脾组织Treg细胞Foxp3蛋白表达；RT-PCR法检测骨髓组织Foxp3 mRNA的表达。结果：与正常组比较，模型组WBC、RBC、HGB、PLT均显著减少（P＜0.01），血涂片示血细胞通透性差、白细胞减少、退化细胞增多，骨髓涂片示脂肪滴明显增加、造血细胞均明显降低、非造血细胞增多；经益髓生血颗粒组治疗后WBC、RBC、HGB、PLT均显著增加（P＜0.01），血涂片及骨髓涂片显示细胞通透性好转、形态趋于正常、脂肪滴明显减少，造血细胞均明显增加，脾组织Foxp3蛋白及骨髓组织Foxp3 mRNA表达明显升高（P＜0.01）。结论：益髓生血颗粒可上调Foxp3的基因及蛋白表达，调控AA免疫功能，进而改善AA免疫环境，促进骨髓造血功能的恢复，发挥治疗AA的重要作用。

再生障碍性贫血大鼠益髓生血颗粒CD4+CD25+调节性T细胞Foxp3

再生障碍性贫血（Aplastic Anemia，AA）患者多表现为贫血、出血、感染等。细胞免疫异常，特别是T细胞异常是AA的主要发病机制之一。近年研究证实CD4+CD25+Treg细胞在AA时中多存在数量及功能的异常[1,2]。叉状头/翅膀状螺旋转录因子P3（Forkhead/ winged Helix Transcription Factor P3，FoxP3）特异性表达于CD4+CD25+Treg细胞，是其特征性标志，可影响CD4+CD25+Treg细胞功能的发挥。本团队前期研究发现AA大鼠存在免疫功能异常，如CD4+、CD8+T淋巴细胞数量及比例异常，Th1/Th2细胞失衡。基于“肾藏精”立方的益髓生血颗粒可改善AA大鼠T淋巴细胞群的紊乱，调节Th1/Th2细胞平衡[3，4]。为进一步研究其调节AA免疫功能的分子生物学机制，本研究采用苯与CTX联合制备AA大鼠模型，观察益髓生血颗粒对AA大鼠Foxp3蛋白及基因表达的影响，探寻CD4+CD25+Treg细胞在AA发病机制中的作用，为益髓生血颗粒治疗AA的免疫机制及临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级、雄性SD大鼠55只，体重200±20 g（购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证：SCXR京2009-0007）。

1.2 实验药物

益髓生血颗粒（中国中医科学院广安门医院，批号：20110506），由熟地、山萸肉、补骨脂、阿胶、炙黄芪、何首乌等共11味中药组成；司坦唑醇片（即康力龙，广西南宁百会药业，批号：100820）。

1.3 主要试剂

苯（北京化工厂，批号：20110808），环磷酰胺（山西普德药业，批号：20101103），Foxp3抗体（英国Abcam艾美捷科技有限公司，批号：ab22510），山羊血清封闭液（北京康为世纪生物科技有限公司，批号：CW0130），GFVisionTMⅡ抗鼠/兔通用型免疫组织化学检测试剂盒（DAKO基因科技公司，批号：GK500705），苏木素染液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI-9610），反转录试剂盒（美国Promega公司，A3500，批号：0000073779），Go Taq®Green Mix（美国Promega公司，M1722，批号：0000040423），DEPC（美国Ameresco公司，批号：E14-25G），异丙醇（北京化工厂，批号：20150524），50×TAE（美国Ameresco公司，批号：13354C413），Goldview、DNA Marker（北京赛百盛基因技术有限公司，批号：20161201、20150801），Foxp3、GAPDH引物合成于生工生物有限公司。

1.4 主要仪器

L340099光学显微镜（日本奥林巴斯公司），552BR电泳仪（美国Bio-RAD公司），153BR转膜仪（美国Bio-RAD公司），C1000PCR仪（美国Bio-RAD公司）。

2 实验方法

2.1 实验动物分组与处理

SD大鼠55只，适应性喂养1周后按体重随机分为正常组10只，造模组45只。将造模组连续7周隔天皮下注射苯（1 mL·kg-1）、取材10天前开始腹腔注射环磷酰胺（25 mg·kg-1），连续3天，制备AA大鼠模型。将造模组大鼠按体重随机分为模型组、司坦唑醇组、益髓生血组。第4周开始灌胃治疗，司坦唑醇组、益髓生血组均按照为成人临床用量的7倍计算灌胃，益髓生血组按3.5 g·kg-1灌胃给药，司坦唑醇组按1.4 mg·kg-1灌胃给药，灌胃剂量为1 mL·100 kg-1）。正常组、模型组给予等量生理盐水灌胃，用药治疗4周。

2.2 标本采集

第8周末取材，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL· 100 g-1）麻醉，股动脉取血1.5 mL于EDTA抗凝管中，摇动混匀，取其中一滴制备血涂片，其余用于检测血常规；无菌摘取大鼠股骨并取少量制备骨髓涂片，剩余骨髓用铝箔纸包裹（铝箔纸需提前使用DEPC水处理），迅速在液氮中固定，后转移至-80℃冰箱保存，用于RT-PCR实验；无菌摘取大鼠脾组织并制备石蜡切片，用于免疫组织化学实验。

2.3 外周血象检查

血常规检测AA大鼠外周血WBC、RBC、HGB、PLT等指标的变化。

2.4 外周血细胞及骨髓细胞形态的观察

制作均匀的血涂片及骨髓涂片，经瑞氏染色，染色步骤参照试剂说明进行，于普通光镜下观察各组大鼠血细胞及骨髓细胞的形态学改变。

2.5 免疫组织化学方法检测脾组织Foxp3蛋白表达

将脾组织石蜡切片脱蜡至水，经消除内源性过氧化物酶活性、微波修复及10%山羊血清封闭后，一抗（Foxp3）浓度1∶100，二抗浓度1∶500，DAB显色，阴性对照用0.1 mol·L-1PBS代替一抗，苏木素复染、脱水并封片。显微镜观察，阳性表达为棕黄色颗粒；每组随机选取8个视野，采用Image pro-Plus6.0进行图像分析，测定阳性表达光密度值（IOD）表示脾组织Foxp3的相对表达量。

2.6 RT-PCR方法检测骨髓组织Foxp3 mRNA表达

应用TrizoL法提取AA大鼠骨髓组织总RNA并逆转录合成cDNA，反应条件如下：15 min（42℃），5 min（95℃），5 min（4℃）。以1μL cDNA为模板，扩增Foxp3、GAPDH，引物序列等详见表1。PCR扩增条件如下：2 min（95℃）、1 min（95℃）、1 min（72℃），38个循环，5 min（72℃）。配置1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，恒压100 V 30 min，紫外凝胶分析仪观察、照相，用Fluor Chem软件对特异性电泳条带进行分析，以Foxp3/GAP⁃DH的IOD比值作为骨髓组织Foxp3 mRNA的相对表达量。

2.7 统计学分析

实验数据应用SPSS 22.0进行分析，实验结果用均数±标准差（xˉ±s）表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有显著统计学意义。

表1 Foxp3及GAPDH基因引物序列及其扩增产物大小

3 结果

3.1 益髓生血颗粒对AA大鼠一般状态的影响

正常组大鼠精神活泼，毛发有光泽，二便及摄食正常；模型组大鼠精神状态不佳，毛发干枯，皮毛松弛蓬乱，部分大鼠有明显脱毛及皮损，大便溏稀，摄食减少，体态较消瘦，大鼠耳廓、唇口、爪甲苍白色，呈明显的贫血貌。与模型组比较，益髓生血组大鼠精神状态逐渐好转，毛发色泽、二便及摄食等均有所改善，尤其是贫血症状改善明显。

3.2 益髓生血颗粒对AA大鼠外周血象的影响

与正常组比较，模型组大鼠外周血中RBC、WBC、HGB、PLT均表达减少（P＜0.01）；与模型组比较，司坦唑醇组、益髓生血组RBC、HGB、PLT均表达增多，且有极显著统计学意义（P＜0.05），司坦唑醇组、益髓生血组WBC均显著性增多，具有极显著统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

3.3 益髓生血颗粒对AA大鼠血细胞及骨髓细胞形态的影响

由图1可见，正常组外周血细胞形态、数量均较正常且细胞分布均匀；与正常组比较，模型组外周血细胞数量减少、大小形态不均，且多呈散状分布；与模型组比较，司坦唑醇组、益髓生血颗粒组外周血细胞形态趋于正常、退化细胞减少。

由图2可见，正常组骨髓组织脂肪滴数量较少，造血细胞较多；模型组骨髓组织脂肪滴数量显著增加，三系细胞均明显降低，存在较多的非造血细胞，司坦唑醇组、益髓生血颗粒组骨髓组织脂肪滴减少，骨髓有核细胞数量增多，非造血细胞数量有所减少。

3.4 益髓生血颗粒对AA大鼠脾组织Foxp3蛋白表达的影响

由表3、图3可知，Foxp3为CD4+CD25+Treg细胞的重要转录因子，定位于细胞核。本次脾组织免疫组化结果显示：脾组织动脉周围淋巴鞘附近Foxp3蛋白表达较多，少量表达于白髓与红髓交界。与正常组比较，模型组脾组织Foxp3蛋白表达明显减少（P＜0.01），与模型组比较，司坦唑醇组、益髓生血颗粒组脾组织Foxp3蛋白表达明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 益髓生血颗粒对AA大鼠外周血象的影响（xˉ±s,n=6）

图1 再生障碍性贫血大鼠血细胞涂片

图2 再生障碍性贫血大鼠骨髓涂片

表3 益髓生血颗粒对AA大鼠脾组织Foxp3表达的影响（xˉ±s,n=8）

图3 益髓生血颗粒对AA大鼠脾组织Foxp3蛋白表达的影响

3.5 益髓生血颗粒对骨髓组织Foxp3mRNA表达的影响

由表4、图4可知，与正常组比较，模型组骨髓组织中Foxp3 mRNA表达明显减少（P＜0.01），与模型组比较，司坦唑醇组、益髓生血颗粒组Foxp3 mRNA表达明显增加（P＜0.05）。

4 讨论

AA是以全血细胞减少为主要特点的血液疾病，多出现贫血、出血、感染等临床症状。中医依据其临床特点将AA归为“虚劳”、“血虚”、“髓劳”等疾病范畴。AA以贫血为其主要症状，中医学认为，血液化生与肾藏精密切相关，《医精经义》曰：“肾藏精，精生髓，髓生骨…精足则髓足”，《黄帝内经·素问》曰：“骨髓坚固，气血皆从”，精髓化生血液主要取决于肾。AA的基本病机在于肾虚，肾不藏精、生髓，髓不化血[7]，血化不足，则出现血虚表现，如面色苍白、头晕乏力、心悸气短、唇甲色淡、眩晕耳鸣等症状，故肾是AA发病的本脏所在。目前，“以肾为本、从肾论治”是治疗AA的主流观点[8]，临床疗效也在实践中不断提高。在“肾藏精，生髓化血”理论指导下，以补肾填精、益髓生血为治疗大法，辅以健脾疏肝、活血化瘀等，调整阴阳，调理五脏，化生气血。王运律[9,10]治疗AA以“补肾为本、辨明阴阳”为原则，健脾补肾，脾肾相协，精血相生，改善骨髓造血功能。庄海峰等[11]用补肾法治疗慢性AA患者36例，分为肾阳虚型、肾阴虚型、肾阴阳两虚型三型，经补肾治疗后，患者临床症状较前明显好转，说明补肾法治疗AA疗效明显，并减少西药不良反应。故本团队依据AA的基本病机及在“肾藏精，生髓化血”的中医经典理论的指导下组方遣药，组成益髓生血颗粒。益髓生血颗粒以补肾益髓为主、辅以健脾养肝，在治疗AA时具有较好的临床疗效。益髓生血颗粒中以山茱萸、何首乌为君药，重在滋补肾阴，辅以补骨脂生发阳气，使阴得阳升而泉源不竭，同时辅以健脾化瘀之味，使血化有源。

表4 益髓生血颗粒对AA大鼠骨髓Foxp3表达的影响（xˉ±s,n=3）

图4 益髓生血颗粒对AA大鼠骨髓Foxp3 mRNA表达的影响

现研究发现，AA时多存在T淋巴细胞的异常激活及分泌过多现象，致使造血负调控因子表达增加，进而诱导造血干细胞凋亡，最终发展为骨髓造血功能衰竭[12，13]。其发病环节以细胞免疫异常为主，其中除免疫激活导致活化的效应性细胞增多如Th1/Th2比例升高，CD8+T细胞增加、CD4+/CD8+比值降低，甚至倒置[14,15]，还伴有自身免疫耐受被打破的过程。Sakaguchi等[16]在1995年首次报道了CD4+CD25+Treg细胞是一类具有免疫调节作用的细胞群。研究证实[17]，CD4+CD25+Treg细胞具有免疫抑制作用，可抑制CD4+、CD8+T细胞的增殖与活化，抑制初始T细胞和记忆性T细胞增殖。CD4+CD25+Treg细胞数量缺乏或功能缺陷会导致机体免疫功能失常，CD4+CD25+Treg细胞数量缺陷是AA患者免疫耐受破坏的重要原因之一[18]。动物实验显示[19]，向AA小鼠模型中注入CD4+CD25+Treg细胞后小鼠骨髓造血功能较前改善。CD4+CD25+Treg细胞与Foxp3基因的表达与机体的免疫状态有着紧密的联系。Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞特异性的转录因子，被公认为是其最具有特异性的分子标志物[20]，是一正向调节蛋白，可调节CD4+CD25+Treg细胞发育和功能，可影响AA时免疫耐受[21]。课题组前期研究证实了AA大鼠外周血存在T细胞的异常活化，其中CD3、CD4细胞数量显著降低，CD8细胞数量相对增多，CD4+/CD8+比值降低，甚至出现倒置。脾组织、骨髓作为主要的免疫器官，在AA的发病中起着重要的作用。T-bet、GATA-3分别为Th1、Th2细胞特异性的转录因子，AA大鼠脾组织、骨髓中T-bet蛋白表达增加，GATA-3蛋白表达降低，经益髓生血颗粒治疗后，IFN-γ、T-bet蛋白表达显著降低，GATA-3蛋白表达显著增加，证实益髓生血颗粒可调节Th1/Th2，调节AA免疫系统、延缓疾病进展[4]。本研究角度从具有特异性免疫调节作用的Treg细胞入手，探讨益髓生血颗粒调控AA免疫耐受的作用机制。

研究结果表明，AA大鼠Foxp3蛋白及mRNA表达下降，说明调节性T细胞减少，故而调节性T细胞的免疫抑制作用减弱，导致T细胞异常活化，引起再障。经益髓生血颗粒治疗后，脾组织Foxp3蛋白、骨髓组织Foxp3 mRNA显著高于模型组，提示补肾益髓生血法可能通过增加Foxp3表达来调节CD4+CD25+Treg细胞，发挥免疫抑制作用，进而促进骨髓造血功能的恢复。本研究阐明了益髓生血颗粒对AA大鼠免疫调节作用机制，部分阐明了益髓生血颗粒治疗AA的作用机制，为临床治疗AA提供新的思路和方向。

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Effect of Yisui Shengxue Granules on CD4+CD25+Foxp3 Regulatory T Cells ofAplasticAnemia in Rats

Tian Chen,Zhao Zongjiang,Zhang Fengfeng,Zhang Xinxue,Cheng Mingxiu, Wang Yinchao,Zhao Jing,Yang Meijuan
(College of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

This paper was aimed to observe the effect of Yisui Shengxue(YSSX)granules on CD4+CD25+regulatory T cells(Treg cells)and its treatment mechanism in aplastic anemia(AA)rats.Male SD rats were selected and randomly divided into different groups according to their weight.In the model group,subcutaneous injection of benzene(1 mL·kg-1) was given every other day for 7 consecutive weeks.Ten days before the rats were sacrificed,intraperitoneal injection of CTX(25 mL·kg-1)was given for 3 consecutive days.On the 4thweek,model rats were divided into the model group, stanozolol group,and the YSSX granules group.Intragastric administration of corresponding drug was given.Same volume of normal saline was given to the normal group and the model group.At the end of the experiment,WBC,RBC, HGB and PLT in peripheral blood were detected.Blood smear and bone marrow smear were prepared.The Foxp3 protein expression of Treg cells in spleen tissues was detected by immunohistochemistry(IHC).RT-PCR was used to detect the Foxp3 mRNA expression in bone marrow tissues.The results showed that compared with the normal group,WBC,RBC, HGB and PLT in the model group were significantly reduced(P＜0.01).The blood smear showed poor permeability of blood cells,reduced WBCs,and increased degenerated cells.The bone marrow smear indicated significantly increased fat drops,significantly reduced hematopoietic cells,and increased nonhematopoietic cells.After the treatment of YSSX granules,WBC,RBC,HGB and PLT were significantly increased(P＜0.01).Both the blood smear and bone marrow smear showed cell permeability improvement,cell form returns to normal,fat drops significantly reduced,significantly increased hematopoietic cells,significantly increased Foxp3 protein expression in spleen tissues and Foxp3 mRNA expression in bone marrow tissues(P＜0.01).It was concluded that YSSX granules can upregulate both gene and protein expression of Foxp3,regulate AA immune function in order to improve the AA immune environment,promote the recovery of bone marrow hematopoietic function,which played an important role in AA treatment.

Aplastic anemia,rat,Yisui Shengxue granules,CD4+CD25+,regulatory T cells,Foxp3

10.11842/wst.2017.05.008

R96

A

（责任编辑：陈宁，责任译审：王晶）

2017-05-06

修回日期：2017-06-05

＊北京中医药大学自主选题项目（2013360YZH010222）：课题名称：益髓生血颗粒对再生障碍性贫血大鼠CD4CD25 Foxp3Treg调节性T细胞的影响，负责人：田晨；科学技术部国家重点基础研究发展计划“973计划”项目（2010CB530400）：基于“肾藏精”的脏象理论基础研究，负责人：王拥军；科学技术部国家重点基础研究发展计划“973计划”项目（2010CB530406）：从障碍性贫血探讨“肾生髓”理论的研究，负责人：吴志奎。

＊＊通讯作者：赵宗江，本刊编委，教授，博士生导师，主要研究方向：中医药防治慢性肾病与障碍性贫血的基础与临床研究。