罗颖，赵之丽，陈科力，刘义梅

基于ITS2序列鉴定白及与其伪品小白及＊

罗颖，赵之丽，陈科力，刘义梅＊＊

（湖北中医药大学药学院教育部中药资源和中药复方重点实验室武汉430065）

目的：通过分析白及与小白及的ITS2条形码序列，鉴定白及与其伪品小白及。方法：以采集自云南、湖北、贵州、湖南、四川的38份白及和小白及叶片为实验材料，提取其总DNA，并PCR扩增其ITS2序列，对序列进行双向测序，并从GenBank上下载2个物种共8条ITS2序列，用MAGA5.0进行序列分析，计算种内、种间遗传距离，构建邻接树。结果：白及与小白及的ITS2序列全长均为259 bp，种间有14个变异位点；ITS2序列种内最大遗传距离0.008，种间最小遗传距离0.040。由所构建的系统聚类树可以看出，不同来源的白及与小白及的样本均分别聚为一支，两者明显分开。结论：利用ITS2序列可快速准确地鉴别白及与小白及。

白及小白及ITS2序列鉴定

白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.和小白及Bletilla formosana（Hayata）Schltr.均为兰科白及属Bletilla Rchb.f.植物，是常用中药材。两者均以假鳞茎入药，但仅白及一种被列入《中国药典》作为药用白及的正品基源植物。白及味苦、甘、涩，微寒，具有收敛止血、消肿生肌等功效，用于治疗咯血吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂、肺结核咯血、溃疡病出血等症[1]。小白及性凉，味苦、微麻，有小毒，具有清热化湿，祛风止痛的功效，可用于治疗消化不良，腹痛，痈疮肿毒，风湿痹痛等症，在云南当地被广泛用治疗肺结核咳嗽[2]。白及与小白及在湖北、四川、陕西、贵州、云南等地都有分布[3]。由于白及与小白及的资源分布具有重叠性，而且原植物的形态在非花期较难区别，同时在假鳞茎形态上区别较小，经加工处理为饮片、粉末时，药材的真伪鉴别难度较大。随着白及价格的上涨，白及野生资源受到极大冲击，小白及充斥市场。但是两者在药效和药性上存在差异，因此建立一种快速、准确鉴定白及与小白及的方法，对于保证白及药材的质量及用药安全具有重要意义。

DNA条形码技术作为物种鉴定的新手段，具有准确、稳定、重现性好，操作简便等优点。ITS2条形码作为DNA条形码候选序列之一，在植物近缘种亲缘关系、药材真伪鉴别等方面应用广泛[4-6]。目前有关白及属植物的鉴定，已有其形态学、理化性质、ISSR DNA分子标记[7-9]，以及利用nrDNA ITS、LFY同源基因内含子2及叶绿体ycf1基因的3条候选条形码鉴定等方面的报道[10]，宋爽等[11]以ITS2序列条形码对药用白及和云南本地种白及进行了分析研究，陈黎等[3]应用ITS2条形码序列对白及药材及8种常见不同属的混伪品进行了鉴定研究。本研究运应用ITS2序列条形码对采集自不同产地的白及和同属伪品小白及进行鉴定。

1 实验材料

1.1 主要仪器与试剂

MM400台式振动混合球磨仪（德国莱驰公司）、HHS-4S数显水浴锅（上海虞龙仪器设备有限公司）、JY1000C电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）、Prime5G PCR仪（英国Techne公司）、Ezup柱式植物基因组DNA提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）、β-巯基乙醇，Buffer PCB，琼脂糖均购于上海捷瑞生物工程有限公司。

表1 白及与小白及样本信息表

1.2 样品来源

从湖北、云南、贵州、四川、湖南5个省采集白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.、小白及Bletilla formo⁃sana（Hayata）Schltr.共2个物种38个样本。新鲜叶片经硅胶干燥保存，原植物材料经湖北中医药大学陈科力教授鉴定。另从GenBank下载2个物种ITS2序列共8条。46份植物材料来源及GenBank号详表1。

2 实验方法

2.1 样品DNA提取用

分别取实验材料的干燥叶片50 mg，用球磨仪研磨2 min（30次/min）,加入600 μL 65℃预热的Buffer PCB和12 μLβ-巯基乙醇，震荡混匀，置于65℃水浴25 min，间或混匀。再采用Ezup柱式植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。

2.2 PCR扩增和测序

序列扩增选用ITS2通用引物ITS2F（5′-AT GC⁃ GATACTTGGTGTGAAT-3′）和ITS3R（5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）。PCR反应体系为25 μL，体系内包含2×Tag PCR Mix 12.5 μL，引物（2.5 μmol·L-1）各1.0 μL、模板DNA 2μL，双蒸水8.5 μL。扩增程序为94℃变性5 min，经过40个循环（94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45s），最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将清晰、明亮、单一电泳条带所对应的PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司行双向测序。

2.3 数据处理

测序峰图应用CodonCode Aligner V4.2.4（Codon⁃Code Co.，USA）校对拼接，去除低质量序列和引物区，46条序列的两端5.8S和28S除去（采用基于隐马尔可夫模型HMMer注释方法）以获得ITS2间隔区序列[12]。将所有序列用MEGA5.0软件进行分析比对，计算K2P遗传距离值并建立NJ系统发育树。

3 结果与分析

3.1 白及与小白及ITS2序列特征分析

不同来源白及和小白及样本共46条序列，比对后长度均为259 bp。白及种内有3个位点变异，分别为86位处A-G变异，137位C-T变异，相对于HNBJ002号样品其他白及样品246位处有碱基G缺失。小白及种内在137位存在A-G变异。白及与小白及种间有14个碱基变异位点，其中特征性位点10个，分别为第6、36、38、44、66、124、136、137、163、174、223位点。变异的位点及碱基变化有一定的规律，即在特定的位点变异，且变异相同，例如在38位处，白及的碱基全部为“T”，而小白及全部为“G”,因此这些变异位点都可作为鉴定的依据，将二者完全分开。白及种内GC含量在62.2%-62.7%，平均GC含量为62.3%，小白及种内GC含量61.4%-61.8%,平均GC含量为61.5%（表2）。

3.2 白及与小白及种内与种间遗传距离分析

白及ITS2序列种内最小遗传距离为0，最大遗传距离为0.008，平均遗传距离为0.003。小白及种内最小遗传距离为0，最大遗传距离为0.004，平均遗传距离为0.001 6。白及和小白及种间最小遗传距离为0.040，最大为0.053,平均遗传距离为0.044。两者种间最小遗传距离显著大于两者种内最大遗传距离，说明采用ITS2序列可以将白及与小白及准确鉴别开（表3）。

3.3 白及与小白及聚类分析

从基于ITS2序列构建的邻接（NJ）聚类树（图1）可

以看出，不同来源的白及样品聚为一支，不同来源的小白及样品聚为另一支，两者明显分开，因此ITS2条形码可以鉴定白及与小白及。

表2 白及与小白及ITS2序列特征

表3 白及与小白及的遗传距离

图1 基于ITS2序列构建的白及与小白及的NJ树

4 讨论

白及是中国常用中药材，由于白及种子繁育困难，人工种植难度较大，导致产区私挖滥采现象严重，野生资源遭到破坏，白及药用资源紧张，市场上白及药材的混伪现象严重，其中白及属混伪现象较为常见。中国分布的白及属有4个种，其中华白及分布范围狭窄，极为罕见，市场用药少见。黄花白及因花色为黄色，显著区别于其他3个物种的粉红至紫红色。而白及和小白及在分类学上特征差异很小，区别仅在于小白及的唇瓣褶片从基部至唇瓣的中裂片均为波状，而白及的唇瓣褶片仅中裂片为波状，从植物形态上进行鉴别困难。同时，白及与小白及都以假鳞茎入药，药材经加工切制后，已经失去原有的性状，从药材性状上也很难区分开。白及与小白及在植株形态，药材性状，显微特征方面都有高度相似性，采用传统的形态学方法进行鉴定非常困难且繁琐[13]。二者在药效和药性上具有一定差异，药材的混用将直接影响到白及临床用药的安全和疗效。因此，对白及和小白及进行深入的鉴定研究，对白及的准确引种栽培，规范商品市场以及临床用药有重要意义。

本研究从5个省份收集38份实验样品，通过Ezup柱式植物基因组DNA提取试剂盒提取植物的总DNA，具有快速、方便，不受有机试剂污染的特点。所提取的DNA经检测，质量均较好。其PCR产物经凝胶电泳检测均可出现单一、明亮的条带，纯化后双向测序成功率达100%，说明ITS2序列在白及与其伪品小白及的鉴定中是有效的DNA区段，ITS2序列引物及其反应条件针对白及和小白及鉴定的稳定性好。

本研究从GenBank上共下载了8条白及与小白及的ITS2序列片段，与实验采集的样品进行对比鉴别。从实验结果可以看出，通过相似性搜索法、最小距离法以及基于ITS2序列构建的NJ树均能将白及与其伪品小白及很好的区分开，说明采用ITS2序列鉴定白及与小白及有较高的可靠性。

由此可见，基于ITS2序列的DNA条形码技术能够有效地鉴定白及与其伪品小白及，为保障白及的临床用药安全和疗效提供了参考依据。

1中国药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医药科技出版社,2015:103.

2马正,马宏坤.中药材白及与小白及的区别.农业与技术,2016,36 (4):250-250.

3陈黎.鄂西北白及产地适宜性与品质评价研究.武汉:湖北中医药大学博士学位论文,2014.

4朱英杰,陈士林,姚辉,等.重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究.药学学报,2010,45(3):376-382.

5高婷,姚辉,马新业,等.中国黄芪属药用植物DNA条形码(ITS2)鉴定.世界科学技术-中医药现代化,2010,12(2):222-227.

6赵莎,辛天怡,侯典云,等.党参药材及其混伪品的ITS/ITS2条形码鉴定研究.世界科学技术-中医药现代化,2013,15(3):421-428.

7孙乐乐,杨永红,刘军凯,等.中药材,2010,33(12):1965-1968.

8赵艳霞,邓雁如,张晓静,等.白及属药用植物化学成分及药理作用研究进展.天然产物研究与开发,2013,25(8):1137-1145.

9和志娇,吕丽芬,杨丽云,等.白芨种质资源遗传多样性的ISSR分析.西南农业学报,2008,21(4):1081-1085.

10吴劲松,张宇思,刘薇,等.白及属药用植物DNA条形码的确立及其应用.药学学报.2014,49(10):1466-1474.

11宋爽,周洋帆,黄丽,等.ITS2条形码对白及属植物的初步分析研究.云南农业大学学报(自然科学),2017,32(1):95-100.

12 Keller A,Schleicher T,Schultz J,et al.5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation.Gene,2009,430（1-2）:50-57.

13苏钛,李学芳,邱斌,等.滇产习用白及类药材的生药学研究.现代中药研究与实践,2015,29(6):18-21.

Identification of Bletilla Striata(Thunb.)Reichb.f.and Bletilla Formosana(Hayata)Schltr.Based on ITS2 Sequence

Luo Ying,Zhao Zhili,Chen Keli,Liu Yimei
(Key Laboratory of Ministry of Education on Traditional Chinese Medicine Resource and Compound Prescription, College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

This study was aimed to identify Bletilla Striata(Thunb.)Reichb.f.and Bletilla Formosana(Hayata)Schltr.by ITS2 sequence.The leaves of 38 samples of Bletilla striata and Bletilla formosana from Yunnan,Hubei,Guizhou,Hunan and Sichuan province were used as experiment materials.The total DNA was extracted.Internal transcribed spacer 2 (ITS2)sequences were obtained by PCR.All of the ITS2 sequences were checked.The 8 ITS2 sequences from two species were downloaded from GenBank.The intraspecific and interspecific Kimura-2-parameter(K2P)distances of Bletilla striata and Bletilla formosana were calculated by MEGA5.0.And neighbor-joining(NJ)tree was constructed. The results showed that the full-length sequences of ITS2 from Bletilla striata and Bletilla formosana were 259 bp,with a total of 14 variable sites.The maximum intraspecific K2P distance of Bletilla striata and Bletilla formosana was 0.008, while the minimum interspecific K2P distance was 0.040.The ITS2 secondary structure showed that different origins of Bletilla striata were gathered together and could be distinguished obviously from Bletilla formosana by NJ tree.It was concluded that ITS2 sequence was able to identify Bletilla striata and Bletilla formosana quickly and accurately.

Bletilla striata,Bletilla formosana,ITS2 sequence,identification

10.11842/wst.2017.05.022

R282.5

A

（责任编辑：张娜娜，责任译审：王晶）

2017-03-21

修回日期：2017-05-01

＊科学技术部重大新药创制国家科技重大专项（2014ZX09304307001）：中药新药安全性检测技术与标准研究，负责人：肖红斌。

＊＊通讯作者：刘义梅，教授，主要研究方向：中药资源及其品质研究。