陈浩，邓悦

冠心病心绞痛代谢组学的证候客观化研究＊

陈浩，邓悦＊＊

（长春中医药大学附属医院长春130021）

目的：利用代谢组学技术检测冠心病心绞痛中医证候中的潜在生物标志物，探讨冠心病心绞痛不同证型的客观化规律。方法：选取健康组、冠心病心绞痛患者气虚血瘀证和气虚血瘀痰浊证，应用液相色谱-质谱联用（LC-MS）的方法，检测健康组和不同中医证型的血清、尿液的内源性代谢物，通过主成分分析（PCA)和正交信号校正偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）的方法分析其代谢谱。结果：在PCA分析中，健康组和气虚血瘀组、气虚血瘀痰浊组之间可以明显的区分开来；气虚血瘀证型的潜在生物标志物有天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亚磺酸；气虚血瘀痰浊证型的潜在生物标志物有马尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺、甘油三酯；气虚证型客观化的表现为缺少生物素、赖氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油、甘氨胆酸。结论：通过代谢组学这项新技术，探讨出冠心病心绞痛气虚血瘀证型、气虚血瘀痰浊证型的不同内源性代谢产物，为临床不同中医证型的预防、诊治提供思路。

中医证型代谢组学液相色谱-质谱联用气虚血瘀证气虚血瘀痰浊证

代谢组学作为新兴的系统生物学技术已经被各学者广泛应用于中医药领域的研究中，它具有终点放大的特点并且可以从网络终端表象的整体角度反映生物体的功能水平，与中医学的整体观念相近，因此，代谢组学技术的引进和利用为中医证候的客观化提供了崭新的平台[1]。另一方面，严重威胁人类健康的冠心病具有病情重，病位深，病程长，且多反复发作、正气多虚、脏腑多损等特点。人们意识到，如果能在器质性疾病形成之前及早的预防，或是延缓病情的发生发展，将会有效的降低冠心病乃至心血管事件链的死亡率。现代学者对冠心病中医证型的分布规律做了相关研究，如吴氏等[2]在对116例住院患者的证候进行调查分析后得出实证（68.94%）明显多于虚证，实证中以血瘀（36.2%）、痰浊（30.2%）最常见；而张氏等[3]在对1989-2004年公开发表于国内各学术斯刊上的425篇学术论文的18 698例病例进行了分析，总结出常见的主要证型，发作期以实证表现突出，实邪主要为血瘀、寒凝、痰浊、气滞4类，血瘀是本病的主要实邪；虚证之中以心气亏虚证最多。本研究在冠心病心绞痛中医证候流行病学调查研究中，选取吉林省三家中医院2014年9月至2015年9月住院或门诊的冠心病心绞痛患者600例，对这600例患者进行了单因素、双因素、三因素统计学调查，发现双因素证型中气虚血瘀和痰瘀互结型分别位居第一、第二位，而三因素证型中气虚血瘀痰浊证型位居首位；根据以上结论，利用代谢组学中液相色谱-质谱联用的技术，分析冠心病心绞痛不同证型间的尿液、血清的代谢产物，探寻中医证候的客观化规律，为冠心病心绞痛的有效防治提供参考和依据。

1 病例标本

1.1 一般资料

健康人来源于长春中医药大学附属医院体检确定其身体健康的志愿者，病理组来源于长春中医药大学附属医院心内科住院部的患者（表1）。所有患者都符合相应的中西医诊断标准和中医诊断标准。

表1 不同组别病例数

1.2 诊断标准

西医诊断标准参照1979年国际心脏病学会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题报告《缺血性心脏病的命名及诊断标准》以及2010年《稳定型冠心病诊治指南》制定冠心病心绞痛的诊断。中医诊断标准参照中国中西医结合学会心血管学会1990年10月修订《冠心病中医辨证标准》。

2 样品取材与预处理

受试者取清晨空腹尿液10 mL，3 000 r·min-1离心10 min后，取上清分装至-80℃冰箱保存；患者采血前1天素食，次日清晨经肘静脉抽取受试者空腹12 h静脉血2-3 mL,室温下经3 000 r·min-1离心后10 min后，取血清至-80℃冰箱保存；健康人同上。统一送至长春应用化学研究所进行代谢组学尿液及血清检测。

3 数据采集与分析

尿液和和血清检测均使用Waters Acquity UPLC液相色谱系统、Q-TOF SYNAPT G2 HDMS质谱仪和Wa⁃ ters CQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm,2.1×50 mm）进行液相色谱质谱联用进行数据采集。数据分析均使用EZinfo 2.0软件中的PCA和OPLS-DA进行多元变量分析。使用SPSS17.0软件进行组间独立样本方差检验。使用生物学数据库，如HMDB(http://www.hmdb. ca/)进行生物标志物的鉴定和代谢通路的分析。

4 结果

4.1 尿液PCA分析结果（图1）

4.2 血清PCA分析结果（图2）

在PCA得分图中每一个点代表一个样品，每个样品的位置由其自身的代谢决定，处于相同生理病理的样品通常具有相似的代谢物，因此得分图上表现出处于相近的地理位置。如果彼此间的差距越大，也就表明其生理病理状态相差越大。在尿液检测中，正离子模式下健康组、气虚血瘀组、气虚血瘀痰浊组之间的代谢通路存在明显差异，而负离子模式下，健康组与气虚血瘀、气虚血瘀痰浊两组之间可以明显区分；在血清检测中，在正离子模式下气虚血瘀痰浊组和健康组、气虚血瘀组这两组可以明显区分，负离子模式下，健康组、气虚血瘀组、气虚血瘀痰浊组之间都可以明显区分，说明三者之间存在显著的代谢差异。

4.3 尿液OPLS-DA分析结果

图1 正、负离子模式下的尿液PCA分析结果

图2 正、负离子模式血清PCA分析结果

图3 气虚血瘀证在正离子模式（A）和负离子模式（B）下的S-plot图（尿液）

图4 气虚血瘀痰浊证在正离子模式（A）和负离子模式（B）下的S-plot图（尿液）

图5 气虚血瘀证在正离子模式（A）和负离子模式（B）下的S-plot图（血清）

图6 气虚血瘀痰浊证在正离模式（A）和负离子模式（B）下的S-plot图（血清）

对气虚血瘀组（图3）和气虚血瘀痰浊组（图4）的尿液进行OPLS-DA[4]分析，建立模型，得出S-plot图。

4.4 血清OPLS-DA分析结果（图5、图6）

分散在S型两端的散点越远，越具有特异性。用交叉验证法进行检验，得到R2Y值和Q2值，R2Y值代表了对模型的验证能力，Q2值代表了对模型的预测能力，它们可以对模型进行有效性评价。理论上R2Y值和Q2值越高，越接近1，说明所建立的OPLS-DA模型质量良好，能够反应原始变量的信息，预测能力也就越强。尿液检测中，气虚血瘀组在正离子模型下的模型评价指标为R2Y=0.99、Q2=0.89，负离子模式下的模型评价指标为R2Y=0.97、Q2=0.85；气虚血瘀痰浊组在正离子模型下的模型评价指标为R2Y=0.99、Q2=0.97，负离子模式下的模型评价指标为R2Y=0.98、Q2=0.87。血清检测中，气虚血瘀组在正离子模型下的模型评价指标为R2Y=0.98、Q2=0.90，负离子模式下的模型评价指标为R2Y=1.00、Q2=0.98；气虚血瘀痰浊组在正离子模型下的模型评价指标为R2Y=0.99、Q2=0.97，负离子模式下的模型评价指标为R2Y=1.00、Q2=0.95，R2Y值和Q2值都反映了模型建立良好。不管在正离子模式下还是负离子模式下，气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组均存在一些特异性标志物。

4.5 对潜在是生物标志进行检索

分散在S型两端的点作为潜在的生物标志物，选择其中VIP值大于1.0的分子量且独立t检验的P＜0.05的化合物作为潜在的生物标志物，通过精确分子量在生物数据库进行正谱和负谱检索，选取可以解释代谢通路且具有代表意义的物质，尿液中检测出：马尿酸（精确分子量179.172 7）、生物素（精确分子量244.311）、天冬氨酰蛋氨酸（精确分子量264.299）、赖氨酰酪氨酸（精确分子量309.360 8）、半胱氨酸亚磺酸（精确分子量151.118）、氨基葡萄糖（精确分子量179.171 1）、果糖胺（精确分子量179.171 1）、磷脂酰甘油（精确分子量512.614 2）；血清中检测出甘油三酯（精确分子量815.299 2）、甘氨胆酸（精确分子量465.622 7）等，对这些物质在三组之间进行非参数检验，得到各物质在三组中的秩均值，对各组别进行组与组的差异性分析，a表示气虚血瘀组和健康组之间的比较，b表示气虚血瘀痰浊组和健康组之间的比较，c表示气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组之间的比较，得出相应的P值（P＜0.05表示两组之间存在差异），根据三组之间的P值，得出相应的变化趋势（表2）。

由表2可知，马尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺、甘油三酯：气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组均高于健康组，但是气虚血瘀组和健康组之间没有差异性；天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亚磺酸：气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组均高于健康组，气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组之间没有差异性；生物素、赖氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油、甘氨胆酸这四种物质气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组均低于健康组，气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组之间没有差异性。

5 讨论

从PCA得分图分析，在尿液检测中，正离子模式下三组之间的地理位置存在着明显差异，提示三组间的体内代谢通路存在本质的差异；在负离子模式下，健康组和气虚血瘀、气虚血瘀痰浊这两组的代谢通路有明显差异。而血清检测中，负离子模式下三组之间的代谢物通路存在着明显差异；在正离子模式下，气虚血瘀痰浊组可以明显和健康组和气虚血瘀组区分开来。相关学者同样在不同中医证型中进行检测对比，华何与等[5]对气滞血瘀证、心血瘀阻证、气虚血瘀证这三种血瘀证患者的血浆分别进行代谢组学的检测，发现气虚血瘀证组可以和其他两组证型明显区分，而气滞血瘀证和心血瘀阻证之间的差别不明显。我们在S-plot图中还探讨出，不管在正离子模式下还是负离子模式下，气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组均存在一些特异性标志物。

相关学者通过代谢组学技术，还检测出许多中医证型的内源性代谢物，如史琦等[6]采用核磁共振技术检测出冠心病血瘀证患者的血浆含有缬氨酸和丙酮；朱明丹等[7]对冠心病不同证型的患者的血浆进行代谢组学研究，同样采用了PCA方法，探讨一些小分子代谢物如葡萄糖、花生四烯酸、亚油酸、苯丙氨酸、磷酸肌酸等与能量代谢、脂质代谢、糖代谢紊乱密切相关。

根据表2中，各标志物的秩均值、各组间的P值和变化趋势，提示尿液中检测出的马尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺这三种物质以及血清中检测出的甘油三酯，气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组虽然均高于健康组，但是气虚血瘀组和健康组之间没有差异性，而气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组存在差异性，提示这四种物质可能代表了气虚血瘀痰浊的特异性，而在痰浊证型中这四种物质明显增多。马尿酸过多反映了肠道微生物菌群失调，氨基葡萄糖、果糖胺的过多反应了糖代谢的紊乱，甘油三酯的过多反应了脂类、能量代谢的紊乱，所以临床中对痰浊证型的患者，要预防胃肠功能紊乱而致的肠道疾病以及要密切关注血糖、血脂的水平。我们检测出马尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺这三种物质可能是气虚血瘀痰浊证潜在的生物标志物，与张红栓等[8]通过对冠心病心绞痛患者的尿液代谢组学检测，发现血瘀证和痰浊证两组的代谢物可以明显区分，且痰浊证组的柠檬酸、酪氨酸、马尿酸等的含量高于血瘀证组具有高度相似性。

天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亚磺酸：气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组均高于健康组，气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组之间没有差异性，提示天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亚磺酸可能为气虚血瘀中特异性标志物，而在气虚血瘀痰浊中并无特异性。天冬氨酰蛋氨酸是由天门冬氨酸和蛋氨酸组成的二肽，这是蛋白质分解代谢的不完整的的分解产物，表明蛋白质处于高代谢的一个状态，所以气虚血瘀证在饮食上是需要补充一定的蛋白质营养。半胱氨酸亚磺酸是氧化还原酶和天门冬氨酸氨基转移酶的副产品，当天门冬氨酸氨基转移酶升高时，提示肝脏疾病可能引起的肝损伤，临床中气虚血瘀证可能存在潜在的肝损伤，需谨慎治疗。

生物素、赖氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油、甘氨胆酸这四种物质气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组均低于健康组，气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组之间没有差异性，提示气虚血瘀证和气虚血瘀痰浊证均缺少这些物质，同时也提示气虚证型—虚性伏邪的物质基础是缺少这些物质。生物素又称维生素H、辅酶R，也属于维生素B族中的B7，它是合成维生素C的必要物质。赖氨酰酪氨酸是赖氨酸和酪氨酸形成的双肽，两种氨基酸都是人体所需要的营养物质，为蛋白质的吸收和利用提供基础。磷脂酰甘油是一种酸性磷脂，磷脂具有促进脂肪代谢，降低血清胆固醇、改善血液循环、预防心血管疾病的作用。甘氨胆酸是由胆酸和甘氨酸结合生成的，然后随胆汁排入肠道，帮助脂肪的消化和吸收。所以临床治疗中，对于气虚证型要注意维生素、氨基酸等营养物质的补充以及控制脂类代谢的紊乱，同样，对于临床中一些缺乏维生素、氨基酸等营养物质的患者可以给予补气的治疗方案。

6 总结与展望

尿液和血清的代谢组学研究中，PCA得分图中可以明显区分出三组样本的差异性；在S-plot图中也可以看到气虚血瘀和气虚血瘀痰浊两组的定性分析，既存在S型两端的黑色点状就是区分彼此的差异性代谢物；对于天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亚磺酸这两种物质，可能为气虚血瘀证型的潜在特异性标志物；马尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺、甘油三酯可能为气虚血瘀痰浊证的潜在特异性标志物；气虚证型—虚性伏邪的物质基础是缺少生物素、赖氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油、甘氨胆酸这四种物质。通过代谢组学这项新技术，探讨出冠心病心绞痛气虚血瘀证型、气虚血瘀痰浊证型的不同内源性代谢产物，为临床不同中医证型的预防、诊治提供思路。

系统生物学的研究方法和中医学体系的整体观念存在着许多的相似性，但将二者结合起来也面临诸多挑战，特别是中医证候的复杂多变性，这就需要技术成熟发展，国内一些学者在传统中医辨证的基础上，一直寻找可以量化冠心病中医证候的新标准，相信通过各学者的不断探索，代谢组学的无创性、高灵敏性的分析特点，逐渐为中医药的现代化所接受，为目前中医药的研究开辟了新的方法和思路，有望使中医辨证实现客观化[9]。

1朱萱萱,王广基,阿基业,等.冠心病中医辨证分型的代谢组学研究.中华中医药学刊,2009,27(6):1267-1269．

2吴辉,于扬文,吴伟,等.116例冠心病患者中医证候及病因分析.江苏中医药.2004,25(10):30-31.

3张秋雁,邓冰湘.冠心病心绞痛临床中医证型分布的回顾性分析.中医研究,2005,18(11):23-24.

4钱国华,荀鹏程,陈峰,等.偏最小二乘法降维在微阵列数据判别分析中的应用.中国卫生统计,2007,24(2):120-123.

5华何与,贾钰华,张红栓,等.冠心病心绞痛三种血瘀证的血浆代谢组学研究.热带医学杂志,2010,10(3):258-260,279,230.

6史琦,王伟,李友林,等.基于代谢组学的冠心病患者血瘀证识别模式研究.中西医结合心脑血管病杂志,2014,12(5):513-516.

7朱明丹.不同证型冠心病患者的血浆代谢组学研究.中医杂志, 2013,54(17):1489-1493.

8张红栓,贾钰华,华何与,等.冠心病心绞痛痰浊证、血瘀证的尿液代谢组学研究.中国中医基础医学杂志,2010,16(2):126-128.

9程鹏,陈泽奇,王东生.冠心病痰浊证与气虚证的代谢组学研究.中国中西医结合杂志,2015,35(2):193-197.

Objectification on Metabolomics of Different Traditional Chinese Medicine Syndromes in Patients with Coronary Heart Disease andAngina Pectoris

Chen Hao,Deng Yue
(Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130021,China)

This study was aimed to investigate potential biomarkers in different traditional Chinese medicine(TCM) syndromes of angina pectoris of coronary heart disease(CHD)by using metabolomic technology,and to explore the objective law of different TCM syndromes of CHD.Endogenous metabolites in serum and urine from the healthy group, and patients with DHD angina pectoris patients of the syndrome of Qi deficiency and blood stasis,as well as the syndrome of Qi deficiency,blood stasis and phlegm turbidity were detected by the liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS).Metabolic profiles were analyzed by the principal component analysis(PCA)and the orthogonal partial least squares discriminant analysis(OPLS-DA).The results showed that in PCA,the healthy group,Qi deficiency and blood stasis group,as well as the Qi deficiency,blood stasis and phlegm turbidity group can be obviously distinguished.Potential biomarkers in the Qi deficiency and blood stasis syndrome contained aspartyl methionine and cysteine sulfinic acid.Potential biomarkers in the Qi deficiency,blood stasis and phlegm turbidity syndrome contained hippuric acid,amino glucose,fructosamine and triglyceride.The objective performance of Qi deficiency syndrome was the absence of biotin,lysyl tyrosine,phosphatidylglycerol and glycocholic acid.It was concluded that through the new metabolomic technology,different endogenous metabolites in the syndrome of Qi deficiency and blood stasis,as well as the syndrome of Qi deficiency,blood stasis and phlegm turbidity of patients with DHD angina pectoris were detected.It provided ideas for the clinical practice of prevention,diagnosis and treatment of different TCM syndromes.

Traditional Chinese medicine syndrome,metabolomics,liquid chromatography-mass spectrometry,Qi defi⁃ciency and blood stasis syndrome,Qi deficiency,blood stasis and phlegm turbidity syndrome

10.11842/wst.2017.05.000

R259

A

（责任编辑：吴朦，责任译审：王晶）

2017-04-21

修回日期：2017-05-20

＊国家中医药管理局国家中医临床研究基地业务建设科研专项课题（JDZX2012070）：冠心病中医证候与伏邪发病机制的流行病学调查及代谢组学研究，负责人：邓悦。

＊＊通讯作者：邓悦，教授，博士生导师，主要研究方向：中西医结合心血管病研究。