刘福权，巫碧清，赵志峰，何强

(四川大学 轻纺与食品学院，成都 610065)

花椒中典型酰胺类物质的提取工艺优化研究

刘福权，巫碧清，赵志峰*，何强

(四川大学 轻纺与食品学院，成都 610065)

为了获得高质量的花椒酰胺类物质，文章采用有机溶剂萃取法进行提取，并利用HPLC法测定花椒中酰胺类物质的含量，在单因素实验的基础上应用响应面法对提取温度、料液比和提取时间进行三因素三水平的优化设计。结果表明：温度与料液比的交互作用明显，而温度与时间、料液比与时间的交互作用不显著(p>0.05)；最佳提取工艺为温度43 ℃，料液比1∶15，时间4.5 h，此条件下的提取率可达7.68%，理论预测值为7.32%。该研究为提取花椒中典型的酰胺类物质提供了参考。

花椒；酰胺类物质；提取工艺；响应面分析

花椒(Zanthoxylumbungeanum)系芸香科花椒属植物，其成熟干燥的果皮作为一种传统的香辛料长期存在于亚洲人的厨房中，因其具有独特的“麻味”以及唾液分泌性质而被誉为中国“八大味”之一[1]。花椒中的酰胺类物质是山椒素和花椒素类物质的总称[2]，因其能通过激活触觉和热感应三叉神经的神经元产生“麻”这一感觉又被广泛地称为麻味物质[3]。从花椒中提取得到酰胺类物质不仅能够为麻味研究提供基础性原料，更是进一步研究其生物活性、药理作用和神经科学分子机制的基础性步骤[4-6]，因此花椒中典型酰胺类物质的提取工艺优化至关重要。目前常见的提取方法主要是有机溶剂萃取法和超临界CO2萃取法。薛小辉[7]研究了青花椒麻味成分的超临界CO2萃取工艺，得到了最优参数；刘雄[8]对比研究了有机溶剂法和超临界CO2萃取法提取花椒中风味物质的工艺条件，得到了提取花椒油树脂的最佳工艺参数，但是文章主要对精油得率进行了工艺优化，并未对花椒中典型的酰胺类物质的有机溶剂提取进行研究。

近年来不断发展的麻味评价方法对花椒中的酰胺类物质提出了更高的要求[9]，而超临界CO2萃取法虽然具有诸多优点，但是因其设备昂贵而难以广泛使用。本文拟通过有机溶剂萃取法提取花椒中典型的酰胺类物质，利用响应面法优化提取工艺参数，建立数学模型，分析不同因素对酰胺类物质提取的影响程度，以期为花椒麻味研究的基础步骤提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

花椒：由四川五丰黎红食品有限公司提供，选用2015年8月采摘于四川汉源的鲜花椒，采收后于40 ℃条件下烘干，常温避光保存备用。

甲醇、碱性氧化铝、乙腈：成都科龙试剂厂；超纯水。

1.1.2 仪器与设备

DZKW-4恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；RE52-99旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；TDZ5-WS低速离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；SHZ-D循环水式真空泵 上海道京仪器有限公司；LC-6AD高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验

分别考察提取温度、时间和料液比对酰胺类物质提取率的影响。称取粉碎至40目的花椒1 g，置于100 mL锥形瓶中，按设定的料液比加入分析纯甲醇，在设定温度下水浴加热一定时间后，减压抽滤。滤液减压蒸干(50 ℃)后加入10 mL分析纯甲醇，超声波辅助溶解。将所得混合溶液过碱性氧化铝层析柱，收集层析液。所得层析液经离心(4000 r/min，10 min)后，取上清液减压蒸干并计重，所得样品即为酰胺类物质提取物。

1.2.2 响应面优化实验

在单因素实验基础上，根据Box-Benhnken的中心组合设计原理，采用响应面法对花椒中酰胺类物质提取工艺参数进行三因素三水平的优化实验。选取提取温度、时间和料液比为自变量，分别用A，B，C表示，以花椒酰胺类物质提取率为响应值，用R表示。实验因素及水平见表1。

表1 响应面实验因素和水平

1.2.3 酰胺类物质的检测

1.2.3.1 标准曲线的绘制

将实验室自制的羟基-α-山椒素标准品配制成不同浓度的溶液，采用HPLC法进行检测，色谱条件：MN Nucleodur 1100-5 C18柱；流动相A：水；流动相B：乙腈；流速：0.5 mL/min；柱温：30 ℃；紫外检测波长：270 nm；进样量：20 μL。洗脱程序见表2。

表2 HPLC洗脱程序

以各浓度溶液在270 nm下吸收峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得到标准曲线方程为y=198648x，R2=0.998，式中：x为麻味物质的质量浓度(μg/mL)，y为270 nm下吸收峰的面积。

1.2.3.2 酰胺类物质含量的测定

取一定量的提取物用色谱级甲醇溶解后过0.22 μm滤膜，使用高效液相色谱仪进行测定，根据标准曲线换算得到花椒中酰胺类物质的含量。

1.2.3.3 酰胺类物质提取率的计算

酰胺类物质提取率(ER)计算公式如下：

式中：c为酰胺类物质质量浓度，μg/mL；V为样品定容体积，mL；d为样品溶液稀释倍数；G为样品的质量，g。

1.2.4 数据处理

实验数据采用SPSS 21进行处理，方差分析采用Duncan模型进行多重比较，显著性水平为5%，采用Origin 8.0绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 温度对酰胺类物质提取率的影响

考察在30，40，50，60 ℃条件下，提取温度对花椒酰胺类物质提取率的影响，结果见图1。

图1 温度对酰胺类物质提取率的影响

由图1可知，当温度为40 ℃时，提取率最大，随着温度继续升高，提取率开始下降，温度对提取率的影响显著(p<0.05)。

当温度较低时，随着温度的升高，分子热运动速率加快，在相同时间内，花椒中酰胺类物质的溶出随着温度的升高而增加。但当温度较高时，温度的继续升高将导致溶剂蒸发速率加快，在相同时间内，体系的料液比降低，提取率下降。此外，由于酰胺类物质为热敏性物质，在高温下不稳定，温度较高可能会导致其发生转化或降解[10]，由此也导致提取率下降。

2.1.2 时间对酰胺类物质提取率的影响

考察温度在40 ℃条件下，提取时间对花椒酰胺类物质提取率的影响，结果见图2。

图2 提取时间对酰胺类物质提取率的影响

由图2可知，花椒中酰胺类物质的提取率在4 h时达到最大值，随着时间延长，6～8 h花椒麻味物质提取率有所下降，但在10 h时又出现峰值，随后提取率继续降低。在2～12 h内，时间对提取率具有显著影响(p<0.05)。

出现2个峰值的原因可能是4 h时正好是1个分离周期，而随着时间延长，花椒中酰胺类物质又进行了1次分离。但是相比第1个分离周期，第2个分离周期所得到的酰胺类物质有所减少，这可能是因为经过1次分离后有机溶剂中已经存在酰胺类物质，导致浓度差减小，传质推动力下降。

2.1.3 料液比对酰胺类物质提取率的影响

考察温度为40 ℃、时间为4 h条件下，料液比对花椒酰胺类物质提取率的影响，结果见图3。

图3 料液比对酰胺类物质提取率的影响

由图3可知，当料液比为1∶15时，酰胺类物质的提取率最大，料液比对提取率的影响显著(p<0.05)。当料液比小于1∶15时，提取率随着料液比的增加而增加，而当料液比大于1∶15时，由于提取已经达到动态平衡，料液比的增加并不会继续提高酰胺类物质提取率，反而由于后续需要延长减压蒸干的时间所导致的酰胺类物质部分分解而有所下降。

2.2 响应面实验结果

采用Box-Benhnken中心组合对酰胺类物质的提取率进行优化设计，结果见表3。

表3 花椒中酰胺类物质提取响应面实验设计及结果

续 表

由表3可知，回归模型的显著性检验p=0.1524>0.05，差异不显著，说明该模型拟合程度不好。因此，需要进一步对模型进行逐步回归分析，得到回归方程为：R=6.44736+0.16052A+0.65773B-0.80348A2。

方差分析见表4。

表4 方差分析表

注：“*”为影响显著(0.01

由表4可知，回归方程的失拟性检验p=0.3002>0.05，差异不显著，这表明所选用的二次回归模型是适当的；回归模型的显著性检验p=0.0106<0.05，差异显著，说明该模型拟合程度好，模型成立。因此，在所选的3个因素中，提取温度和料液比对花椒酰胺类物质提取率具有显著影响，而提取时间作为不显著因素被剔除，表明提取时间对于花椒酰胺类物质提取率并无显著影响。

由分析结果可知，当温度为43.08 ℃、料液比为0.06、时间为4.45 h时，提取效果最好，提取率为7.32%。因此，选择最佳提取工艺参数为温度43 ℃，料液比1∶15，时间4.5 h。

回归模型的响应曲面图及其等高线图见图4～图6。

图4 料液比和提取温度的交互作用

图5 温度和提取时间的交互作用

图6 料液比和提取时间的交互作用

由图4～图6可知，提取温度与料液比的响应曲面图较为陡峭，且交互的等高线图近似椭圆形，说明提取温度与料液比的交互作用较为明显。而提取温度与提取时间、料液比与提取时间的响应曲面图较为平缓，且交互的等高线图近似圆形，表明提取温度与提取时间、料液比与提取时间的交互作用并不显著(p>0.05)，该结果与方差分析结果相吻合。

3 结论

在单因素实验的基础上，通过响应面优化实验得到采用有机溶剂萃取法提取花椒中典型酰胺类物质的最优参数为提取温度43 ℃，料液比1∶15，提取时间4.5 h，此条件下提取率可达7.68%。本文通过逐步回归模型成功拟合得到了提取率的方程，阐述了提取温度和料液比对酰胺类物质提取率具有显著影响，而提取时间无显著影响。

本文较为系统地阐述了花椒中典型酰胺类物质的提取优化过程，得到了以甲醇为溶剂条件下的最佳提取工艺，但在不同溶剂下酰胺类物质传质过程的对比研究还鲜有报道，或可作为未来研究的方向。

[1]Mizutani K,Fukunaga Y,Tanaka O,et al.Amides from huajiao,pericarps ofZanthoxylumbungeanumMaxim[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin,1988,36(7):2362-2365.

[2]Galopin C C,Furrer S M,And A G.Pungent and tingling compounds in Asian cuisine[J].Acs Symposium Series,2009,224(33):139-152.

[3]Bryant B P,Mezine I.Alkylamides that produce tingling paresthesia activate tactile and thermal trigeminal neurons[J].Brain Research,1999,842(2):452-460.

[4]Supabphol R,Tangjitjareonkun J.Chemical constituents and biological activities ofZanthoxylumlimonella(Rutaceae):a review[J].Tropical Journal of Pharmaceutical Research,2014,13(12):2119-2130.

[5]Li Hua Cao,Yun Jung Lee,Dae Gill Kang,et al.Effect ofZanthoxylumschinifoliumon TNF-α-induced vascular inflammation in human umbilical vein endothelial cells[J].Vascular Pharmacology,2009,50:200-207.

[6]Bautista D M,Sigal Y M,Milstein A D,et al.Pungent agents from Szechuan peppers excite sensory neurons by inhibiting two-pore potassium channels[J].Nature Neuroscience,2008,11(7):772-779.

[7]薛小辉.青花椒麻味成分的提取与分离[D].雅安:四川农业大学,2013.

[8]刘雄.花椒风味物质的提取与分离技术的研究[D].重庆:西南农业大学,2003.

[9]Bader M,Stark T D,Dawid C,et al.All-trans-configuration inZanthoxylumalkylamides swaps the tingling with a numbing sensation and diminishes salivation[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(12):2479-2488.

[10]Yang X.Aroma constituents and alkylamides of red and green huajiao (ZanthoxylumbungeanumandZanthoxylumschinifolium)[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(5):1689-1696.

Research on Optimization of Extraction Process ofTypical Amides inZanthoxylumbungeanum

LIU Fu-quan, WU Bi-qing, ZHAO Zhi-feng*, HE Qiang

(College of Light Industry, Textile and Food Engineering, SichuanUniversity, Chengdu 610065, China)

To obtain the high-quality amides fromZanthoxylumbungeanum, the organic solvent extraction is used and the amides content ofZanthoxylumbungeanumis determined by HPLC. On the basis of single factor experiment, the response surface method is applied to extraction temperature,solid-liquid ratio and extraction time for optimal design of three factors and three levels. The results show that the interaction between temperature and solid-liquid ratio is obvious, however, the interaction between temperature and time as well as the interaction between solid-liquid ratio and time are not significant(p>0.05).And the optimal extraction process is temperature of 43 ℃, solid-liquid ratio of 1∶15,time of 4.5 h, the extraction rate can reach 7.68% under such conditions, and the predicted value is 7.32%. The study can provide a reference for the extraction of typical amides fromZanthoxylumbungeanum.

Zanthoxylumbungeanum;amides;extraction process;response surface analysis

2017-02-20 *通讯作者

国家自然科学基金(21502128)

刘福权(1992-)，男，辽宁抚顺人，硕士，研究方向：食物资源利用。

TS264.29

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.08.006

1000-9973(2017)08-0025-05