瞿城 唐于平 史旭芹 周桂生 尚尔鑫 尚丽丽 郭建明 刘培 +赵菁 赵步长 +段金廒 +��

[摘要]基于主成分分析（PCA）、聚類热图分析和多指标综合指数法，评价丹参红花药对不同制法（乙醇、50%乙醇和水）对急性血瘀大鼠血液流变学和凝血功能的影响，优选丹参红花药对活血化瘀作用的最佳提取方式。采用皮下注射盐酸肾上腺素和冰水浴共同刺激复制大鼠急性血瘀模型，通过测定全血黏度（WBV）、血浆黏度（PV）、血沉（ESR）和红细胞压积（HCT），观察丹参红花药对不同制法、不同剂量对血瘀大鼠血液流变学的影响；通过测定活化部分凝血酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）、血浆纤维蛋白原（FIB）含量及血小板最大聚集率（ADP），观察丹参红花药对不同制法对血瘀大鼠凝血功能及血小板聚集的影响。采用PCA、聚类热图分析和多指标综合指数法综合评价丹参红花药对不同制法的总活血化瘀效应。与空白组比较，模型组大鼠血液流变学和凝血功能指标均有显著性差异；与模型组比较，不同制法丹参红花药对低、中、高3个剂量给药组均能较好地改善血瘀大鼠的血液流变学和凝血功能指标，并呈一定的量效关系。综合PCA、聚类热图分析和多指标综合指数法评价得出，丹参红花药对不同制法、不同剂量组中50%乙醇高剂量组的活血化瘀作用最好；相同剂量下，不同制法中50%乙醇给药组活血化瘀效应较好。以上结果说明，不同制法丹参红花药对能明显改善血瘀大鼠的血液流变学及凝血功能异常，且50%乙醇提取丹参红花药对活血化瘀的作用最优，为临床更有效应用丹参红花提供了科学依据。

[关键词]丹参； 红花； 活血化瘀； 不同制法； 急性血瘀； 化学计量学； 多指标综合指数法

Comparative study on promoting blood effects of DanshenHonghua herb

pair with different preparations based on chemometrics and multiattribute

comprehensive index methods

QU Cheng1， TANG Yuping1*， SHI Xuqin1， ZHOU Guisheng1， SHANG Erxin1， SHANG Lili1， GUO Jianming1， LIU Pei1， ZHAO Jing2， ZHAO Buchang2， DUAN Jinao1

（1 Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，

Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of Traditional Chinese Medicine Formulae，

Key Laboratory of Chinese Medicinal Resources Recycling Utilization， State Administration of Traditional Chinese Medicine，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China；

2 Buchang Pharmaceutical Co， Ltd， Xi′an 710000， China）

[Abstract]To evaluate the promoting blood circulation and removing blood stasis effects of DanshenHonghua（DH） herb pair with different preparations （alcohol， 50% alcohol and water） on blood rheology and coagulation functions in acute blood stasis rats， and optimize the best preparation method of DH based on principal component analysis（PCA）， hierarchical cluster heatmap analysis and multiattribute comprehensive index methods Ice water bath and subcutaneous injection of adrenaline were both used to establish the acute blood stasis rat model Then the blood stasis rats were administrated intragastrically with DH （alcohol， 50% alcohol and water） extracts The whole blood viscosity（WBV）， plasma viscosity（PV）， erythrocyte sedimentation rate（ESR） and haematocrit（HCT） were tested to observe the effects of DH herb pair with different preparations and doses on hemorheology of blood stasis rats； the activated partial thromboplastin time（APTT）， thrombin time（TT）， prothrombin time（PT）， and plasma fibrinogen（FIB） were tested to observe the effects of DH herb pair with different preparations on blood coagulation function and platelet aggregation of blood stasis rats Then PCA， hierarchical cluster heatmap analysis and multiattribute comprehensive index methods were all used to comprehensively evaluate the total promoting blood circulation and removing blood stasis effects of DH herb pair with different preparations The hemorheological indexes and coagulation parameters of model group had significant differences with normal blank group As compared with the model group， the DH herb pair with different preparations at low， middle and high doses could improve the blood hemorheology indexes and coagulation parameters in acute blood stasis rats with doseeffect relation Based on the PCA， hierarchical cluster heatmap analysis and multiattribute comprehensive index methods， the high dose group of 50% alcohol extract had the best effect of promoting blood circulation and removing blood stasis Under the same dose but different preparations， 50% alcohol DH could obviously improve the hemorheology and blood coagulation function in acute blood stasis rats These results suggested that DH herb pair with different preparations could obviously ameliorate the abnormality of hemorheology and blood coagulation function in acute blood stasis rats， and the optimized preparation of DH herb pair on promoting blood effects was 50% alcohol extract， providing scientific basis for more effective application of the DH herb pair in modern clinic medicine

[Key words]Danshen； Honghua； promoting blood circulation and removing blood stasis； different preparations； acute blood stasis； chemometrics； multiattribute comprehensive index method

药对是中医临床常用的相对固定的两味药的配伍组合，是中药配伍应用的基本形式[1]。丹参红花是经典活血化瘀相须药对，丹参为唇形科植物Salvia miltrorrhiza Bge的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，被列为上品，味苦、性微寒，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神的功效；红花为菊科植物Carthamus tinctorius L的干燥管状花，始载于《开宝本草》，味辛微苦、性温，具有活血通经、祛瘀止痛、解毒的功效，为活血化瘀要药。两者皆入心、肝经，丹参性寒主降，行而不伤，有利于营血新生；红花性温主升，补而兼行、补而兼通，两药同用，一升一降，内外通和，使行气活血之功尤为显著；二药合用祛瘀生新，除邪而不伤正，共奏活血通络、祛瘀生新之功[24]。丹参与红花配伍后的提取物在临床上被广泛用于治疗心脑血管疾病[5]，现已被开发成20多种中成药，其中，丹红注射液年销售额已超40亿。现代研究表明，丹参中的有效成分主要是以丹酚酸B为代表的丹参总酚酸类以及以丹参酮ⅡA为代表的丹参酮类成分，红花中的活性成分主要为以羟基红花黄色素A为代表的查耳酮类和黄酮类成分，这些成分在丹参红花活血化瘀效应方面均发挥了重要作用[67]。本课题组前期研究发现，不同制法、不同比例的丹参红花配伍合煎能促进丹酚酸类、丹参酮类、查耳酮类和黄酮类成分的溶出，但其配伍后活血化瘀的功效变化未见报道[8]。

本实验在前期研究基础上，选择丹参红花（3∶1）药对不同制法（乙醇、50%乙醇、水）提取物为研究对象，观察该药对不同制法、不同剂量对急性血瘀模型大鼠的血液流变学、凝血功能及血小板聚集的影响。采用主成分分析（PCA）联合聚类热图分析、多指标综合指数法对不同制法的丹参红花药对活血化瘀效应进行综合比较分析，以期通过整体动物实验，探讨丹参红花发挥活血化瘀功效的基本规律，为阐明该药对的作用机制及配伍规律奠定基础。

1材料

11动物SPF级健康SD大鼠，雌性，体质量220～250 g，购于上海杰思捷实验动物有限公司，许可证号SCKY（沪）20130006。

12药品与试剂复方丹参滴丸（天士力制药集团股份有限公司，批号151227）；阿司匹林肠溶片（拜耳医药保健有限公司，批号BJ24257）；盐酸肾上腺素注射液（上海禾丰制药有限公司，批号160609）；水合氯醛（国药集团试剂有限公司，批号20161121）；一次性使用人体静脉血样采集容器（32%枸橼酸钠抗凝，江苏康洁医疗器械有限公司，批号20161105）。活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）、血浆纤维蛋白原（FIB）试剂盒，均购自北京世帝科学仪器公司。

13药材的鉴定与提取丹参（山东临沂，批号160401），红花（新疆伊犁，批号160401）药材购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，并经南京中医药大学陈建伟教授鉴定分别为唇形科植物丹参S miltiorrhiza的干燥根和根茎，菊科植物红花C tinctorius的干燥花，均符合《中国药典》2015年版项下标准。

丹参红花按3∶1比例混匀，共500 g，分别进行热回流水提取、热回流50%乙醇提取和热回流乙醇提取，依次用10倍量的溶剂进行热回流提取3次，每次15 h，自然冷却后，倾出溶液，过滤药渣，合并3次提取液进行真空减压浓缩至每克浸膏1 g生药，得制备样品，冷藏备用。

14仪器LGR80B电脑血液黏度测试仪（北京世帝科学仪器公司）；LGPABER1型血小板聚集凝血因子分析仪（北京世帝科学仪器公司）；Anke LXJIIB离心机；Anke TDL40B（上海安亭科学仪器厂）；电子分析天平（BT125D，sartorius，德國）。

2方法

21急性血瘀大鼠模型的建立除空白组外，其余各组大鼠均皮下注射盐酸肾上腺素注射液08 mg kg-1，共2次，间隔时间为4 h。第一次皮下注射盐酸肾上腺素后2 h，将大鼠置于0～2 ℃冰水中游泳4 min，复制大鼠急性血瘀模型[9]。最后一次皮下注射盐酸肾上腺素后大鼠禁食不禁水饲养，12 h后腹主动脉取血检测血液流变学和凝血功能相关指标。

22分组与给药将78只SD大鼠按体质量随机分为13组，每组6只，分别为正常组、模型组、复方丹参滴丸（DSDW）、阿司匹林（ASPL）阳性对照组、不同提取方式的丹参红花药对低、中、高剂量组（DH低，DH中，DH高）。阳性对照组大鼠灌胃给予复方丹参滴丸、阿司匹林，剂量为每次010 g·kg-1[1012]；空白组和模型组大鼠灌胃给予等体积生理盐水；丹参红花（以药典为基准，设定丹参红花药对总量16 g为临床1倍量）各组大鼠均按临床1，2，5倍量灌胃给药，其生药量分别为144，288，720 g·kg-1。所有给药组大鼠统一灌胃给药，每次每100 g体质量1 mL，每日2次，早晚各1次，共7次，第5次给药后除空白组外其余各组按照相应的造模方法复制急性血瘀模型，于第7次给药后30 min腹主动脉取血，测定血液流变学及凝血功能相关指标。动物给药剂量按体表面积换算系数计算：人临床用量×0018/200×1 000×临床等效量的倍数（g生药/kg大鼠体质量）[9]。

23检测指标各实验组大鼠均于第7次给药30 min后，采用10%水合氯醛进行麻醉，腹主动脉插管进行取血，以枸橼酸钠（38%）1∶9抗凝，吸取1 mL全血置于压积管中静置1 h读数记录血沉（ESR），然后3 000 r·min-1离心30 min，读数记录红细胞压积（HCT）。使用LGR80 B电脑血液黏度测试仪测定全血黏度（WBV）；测完全血黏度的全血，800 r·min-1离心10 min后吸取富血小板血浆（PRP），采用LGPABER型血小板聚集凝血因子分析仪测定血小板聚集率（ADP），然后3 000 r·min-1离心10 min吸取贫血小板血浆（PPP），使用LGR80 B电脑血液黏度测试仪测定血浆黏度（PV），LGPABER1型血小板聚集凝血因子分析仪测定凝血功能相关指标（APTT，PT，TT，FIB）。血浆TT，PT，APTT和FIB的测定按照相应试剂盒说明书进行。

24统计学分析实验数据采用SPSS 190软件中的Descriptives进行统计，实验结果采用±s表示；与正常组和模型组比较采用软件中ANOVA中的Dunnett法进行组间两两比较，P<005表示差异具有统计学意义。

25效应整合依据多指标综合指数法，对WBV，PV，ESR，HCT，TT，PT，APTT，FIB和ADP多个指标进行单一化处理，计算各给药组的总活血效应值。首先对各指标数据进行标化，当模型组的相应指标数值（Value）与正常组相比升高时，V标化=（V模型-V给药） / V模型；当模型组的相应指标数值与正常组相比降低时，V标化=（V给药-V模型） / V模型。标化指标的权重首先依据这些指标在临床中的重要性，查阅5年来急性血瘀相关文献160余篇，其中132篇检测了WBV，129篇检测了PV，121篇检测了HCT，110篇检测了FIB，65篇检测了APTT，62篇检测了PT，53篇检测了ADP，49篇检测了TT。然后结合同行专家对各指标在活血化瘀效应整体评价中的相对程度打分，最后再依据直观的变量重要性投影值（variable importance in the projection，VIP）处理结果综合给出各指标的权重系数，其中，总活血效应值即为各指标标化值乘以权重的加和值[1113]。各个指标VIP值的计算是将各组大鼠的所有指标导入MassLynx v41（Waters公司）软件的EZ info中，采用主成分分析法（principal components analysis，PCA）中的Pareto进行规格化处理得到各组活血化瘀效应的得分图。然后采用软件中的偏最小二乘法（partial least squares method，PLS）分析得到各个指标的VIP值，依据VIP值的大小判断各个指标对分类的重要程度，一般VIP>1的指标认为其对分类的贡献比较大[14]。最后确定WBV，PV和HCT取权重系数为3，FIB取权重系数为2，APTT，PT，TT，ADP和ESR取权重系数为1，总活血效应值即为各指标的标化值乘以权重系数后的加和值，综合主成分分析法的得分图和多指标综合指数法中的总活血化瘀效应值总体评价不同制法丹参红花药对的活血化瘀功效。

3结果

31丹参红花药对不同制法对急性血瘀大鼠血液黏度的影响与正常组相比，模型组大鼠的WBV和PV均显著升高，差异有统计学意义（P<001）。与模型组比较，各给药组的WBV和PV均有一定程度的降低。WBV检测结果显示，在不同制法的丹参红花药对低剂量组中，除了乙醇和水提取物低剂量组在切变率为30 s-1和200 s-1时的黏度没有显著性差异，以及乙醇、50%乙醇提取物的低剂量组在切变率为1，5，200 s-1的黏度没有显著性差异外，其他各低剂量组均有显著性差异（P<001或P<005）；不同制法的中、高剂量组除了50%乙醇和水提取物的中剂量组在切变率为200 s-1时，以及乙醇提取物的中剂量组在切变率为30 s-1的黏度没有显著性差异外，其他部位的中、高剂量组的WBV差异均有统计学意义（P<001或P<005）。PV中，除了丹参红花药对乙醇提取物的低剂量组外，其他给药组差异均有统计学差异（P<001），结果见表1。

32丹参红花药对不同制法对急性血瘀大鼠ESR和HCT的影响与正常组比较，模型组ESR，HCT均显著升高，差异具有统计学意义（P<001或P<005）。与模型组相比，各给药组大鼠的ESR和HCT均有一定程度的降低。ESR检测结果显示，丹参红花药对除了乙醇和水提取物的低剂量组外，其他各给药组的ESR均明显降低（P<005或P<001）。HCT检测结果显示，丹参红花药对50%乙醇提取物中剂量组的HCT明显降低（P<005）；各给药高剂量组的HCT均明显降低，且差異具有统计学意义（P<005），结果见表2。

33丹参红花药对不同制法对急性血瘀大鼠凝血功能的影响与正常组比较，模型组的凝血4项（APTT，PT，TT，FIB）和ADP均有显著性差异（P<001），其中APTT，PT和TT均明显降低，FIB和ADP含量显著升高。与模型组比较，丹参红花药对不同制法低、中、高剂量组中，除了50%乙醇提取物的低剂量组的FIB较模型组无明显变化，其他各实验组均有显著性差异（P<001或P<005）；ADP中，丹参红花药对不同制法的低、中、高剂量组ADP均有显著性差异（P<001或P<005），结果见表2。

34基于PCA法的丹参红花药对不同制法的活血化瘀效应评价将所有指标的源数据导入MassLynx v41（Waters公司）软件的EZ info中作主成分分析，通过降维建立包含第1个主成分t[1]与第2个主成分t[2]二维空间的PCA分类模型，见图1。第1个主成分轴是原始数据矩阵方差最大方向，第2个主成分轴式方差次大方向，降维时最大限度保留有用信息，寻找能够使不同种类样品得到最大分离的方向。可以看出，正常组中心大约是（5，-15），模型组中心大约是（-475，-15），DSDW组中心大约是（10，-05），ASPL组中心大约是（25，-125），丹参红花药对乙醇、50%乙醇和水提取物低剂量组中心依次大约是（-275，-025），（-20，125），（-225，10）；中剂量中心依次大约是（-075，075），（075，075），（-025，1）；高剂量组中心依次大约是（075，05），（325，-02），（175，12）。丹参红花药对不同制法提取物的高剂量组的中心离空白组最近，说明高剂量组的活血化瘀效应较好，其中，50%乙醇提取物的高剂量组的中心离正常组最近，表示该组对急性血瘀大鼠的改善作用最好；丹参红花药对不同制法提取物的中剂量组介于空白组和模型组的中心，表明它们对急性血瘀大鼠的改善作用弱于高剂量组；丹参红花药对不同制法提取物的低剂量组的中心离模型组最近，表示它们对急性血瘀大鼠的改善作用较弱。整体而言，在实验的剂量范围内，丹参红花药对随着剂量的增加，其活血化瘀疗效也相应的增强，呈现一定的量效关系。

35基于多指标综合指数法的不同制法丹参红花药对的活血化瘀效应整合将各组大鼠所有指标的源数据导入MassLynx v41（Waters公司）软件的EZ info中，采用偏最小二乘法分析得到各个指标的VIP，见图2，VIP越大，说明在本实验中该指标对分类的贡献越大[11]。WBV（1 s-1），HCT，FIB和APTT的VIP均大于1，PV，WBV（5 s-1），TT，WBV（30 s-1），WBV（200 s-1），ESR，ADP和PT的VIP较小。采用本课题组前期的多指标综合指数法对各指标进行归一化处理，得到各组的总活血化瘀效应值，见表3，进而得到不同制法的丹参红花药对的总活血效应值，见图3，大小顺序依次为：DH50%A高>DHW高>DHA高>DH50%A中>DHW中>DHA中>DH50%A低>DHW低>DHA低，说明丹参红花药对50%乙醇提取物的高剂量组的总活血效应值最

好。由此表明，不同制法的丹参红花药对在相同剂量下，50%乙醇提取物的总活血效应皆优于其他组，而乙醇提取物的总活血效应最差；提取方式相同时，丹参红花药对提取物在实验剂量范围内，随着剂量的增加，各组的活血作用均有所加强，呈现一定的量效关系。

36不同制法丹参红花药对的活血化瘀效应整合的聚类热图分析基于丹参红花药对不同剂量的生物活性数据，建立不同指标的量效关系数学模型，根据这些模型，每一个生物活性数据都能转化成剂量数据，从而形成热图，见图4，并采用聚类的方法对不同制法、不同剂量组的活血化瘀效应进行相应的统计分析，从而对不同制法丹参红花药对样品差异性进行了区别。丹参红花药对50%乙醇和水提取物的高剂量时活血化瘀效应非常相近，对急性血瘀大鼠的改善效果接近于阳性药，同时50%乙醇和水提取物的低剂量组，乙醇和水提取物的中剂量组，乙醇提取物的高剂量组和50%乙醇提取物的中剂量组活血化瘀效应相似，同一制法的丹参红花药对随着剂量的增加，其活血化瘀疗效也相应的增强，呈现一定的量效关系。

37结合PCA法、聚类热图分析和多指标综合指数法综合评价丹参红花药对不同制法活血效应综合PCA法、聚类热图分析和多指标综合指数法中的总活血化瘀效应结果可知，丹参红花药对不同提取物，随着剂量的增加，活血化瘀效应均有所加强，呈现一定的量效关系，其中50%乙醇提取物的高剂量组的总活血化瘀效应最好，3种分析方法所得结果相一致。这可能与50%乙醇提取时丹参红花药对中发挥活血化瘀功效的有效成分溶出增多有关。

4讨论

中医学认为，凡离经之血不能及时排出和消散，停留于体内，或因气虚、气滞、寒凝、热结、痰阻、湿浊、外伤、饮食、七情等病因所致血行不畅，停遏于经脉之内，及瘀积于脏腑组织器官的，均称为瘀血[15]。寒凝與气滞是导致血瘀的主要原因之一，肝气郁结，疏泄不利，血的运行可因之而阻塞；寒侵于经，经脉瑟缩而拘急，血液凝涩而失畅行，常可因之而瘀滞。已知机体处于暴怒状态时能自主分泌大量肾上腺素，高儿茶酚胺血症常与红细胞黏聚性相关，故大鼠皮下给予大剂量盐酸肾上腺素模拟“暴怒”时的机体变化，以冰水浴模拟“寒邪”入侵，两者交替运用促使血液迅速呈现“浓、黏、凝、聚”的淤血模型特征状态[16]，并以复方丹参滴丸和阿司匹林作为活血药物的阳性对照，对模型进行了有效性验证。

现代研究认为，血瘀证最典型的变化是血液流变性的异常改变，血液流变性异常，会引起机体血液循环障碍，以血液黏度增加为首要因素，凝血功能障碍也是其一因素[17]。为了综合反映不同制法丹参红花药对的活血化瘀药效，本实验选择了血液流变学（WBV和PV），凝血功能（TT，PT，APTT和FIB），HCT，ESR与ADP多个效应指标来综合评价其药效。但各指标的评价基点和药物对各指标的反应灵敏度往往不一致，因此为了对不同样品的终末效应有一个整体的、直观的认识，需要对这些指标进行标化，并统一计量单位，形成整合效应以综合评价。

多指标综合指数法是将多个不同类别、不同性质、不同计量单位的指标标准化，最后转化成一个无量纲的相对评价值，并能反映事物相对水平和整体变动的一种综合评价方法[18]。PCA属于多指标综合评价法中的客观赋权法，该方法是通过恰当的数学变换，使新变量主成分成为原变量的线性组合，并选取少数几个在变差总信息量中比例较大的主成分来分析事物的一种方法[1920]。此外本文采用比较常用、方法成熟且易操作的专家评分法结合相关效应指标在文献中出现的频次来综合确定权重系数，在一定程度上弥补了专家评分法的不足，并采用PLSDA中的VIP对血液流变学及凝血功能各指标进行了评分，因此本文综合各方法对丹参红花的各效应指标进行评分，为权重系数的确定提供了客观的理论依据[2122]。

结合多指标综合指数法和PCA对急性血瘀大鼠的血液流变学和凝血功能指标进行整合，结果显示，丹参红花50%乙醇提取物高剂量组与空白组的PCA聚类图最为接近，提示50%乙醇提取的给药组更有利于模型趋向正常。有研究表明，丹参中水溶性丹酚酸类成分为丹参治疗心血管疾病的主要药效物质基础，其中含量最高的2个成分丹酚酸A和丹酚酸B活性最强，具有抗氧化、抗凝、抗血栓等药理作用；红花对心血管系统保护作用主要表现为改变血液流变性，改善微循环，降低血液黏度等。其中，羟基红花黄色素A是红花黄色素中最重要的成分，是发挥心血管药理作用的主要有效成分[67]。前期研究发现，同一比例的丹参红花不同制法下，除了丹参酮类成分，丹酚酸类、醌式查耳酮类、黄酮类成分在50%甲醇制法下的相对溶出度均明显高于相同条件下水提与甲醇提的相对溶出度[8]，说明在水提取时有利于水溶性丹酚酸类、醌式查耳酮类和黄酮类成分的有效溶出，同时适当增加一定比例的醇溶剂可以进一步促使其相对溶出，这些主要活性物质溶出度的增加可能与促使丹参红花药对活血化瘀协同效应的发挥有着密切的关系。这些研究结果为阐释和优化丹参红花的配伍应用提供了科学依据，也为药对配伍研究提供思路与方法。

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[责任编辑张宁宁]