刘肖 刘娟 庞建云 申宝德 沈成英 连王权 李小芳 袁海龙

[摘要]采用BoxBehnken设计效应面法优化一种微型化介质研磨法制备槲皮素纳米混悬剂（QTNS）的工艺参数并評价所制得的QTNS的体外累积释放度。结果显示，以最优工艺参数：氧化锆珠子45 mL、研磨速度690 r·min-1、研磨时间15 h，制得的QTNS的粒径为（169±5） nm，多分散度指数为0204±0006，稳定系数为0827±0014，且理论预测值与实测值偏差较小，模型具有良好的预测性；在120 min体外累积释放度实验中，QTNS明显高于原料药和物理混合物。使用该种微型化介质研磨法能成功制备QTNS，且该方法中原料药消耗少，工艺简单、操作方便，可为纳米制剂的制备提供新的参考。

[关键词]槲皮素； 纳米混悬剂； 微型化介质研磨法； 体外释放

Preparation of nanosuspension of quercetin with a miniaturized milling method

LIU Xiao1， 2， LIU Juan1， PANG Jianyun1， SHEN Baode2， SHEN Chengying2，

LIAN Wangquan2， LI Xiaofang1*， YUAN Hailong2*

（1 College of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China；

2 Department of pharmacy， Air Force General Hospital， PLA， Beijing 100142， China）

[Abstract]The nanosuspension of quercetin （QTNS） was prepared by a miniaturized milling method， and the process was optimized by BoxBehnken response surface method Then the accumulative release rate of QTNS in vitro was determined The results showed that the optimal process parameters were as follows： ZrO2 45 mL， milling speed 690 r·min-1 and milling time 15 h； the particle size of QTNS was （169±5） nm， polydispersity index of 0204±0006 and stability index of 0827±0014， respectively There was a little deviation between the theoretically predicted value and the measured value， indicating that this model had a good prediction effect The accumulative release rate in vitro of QTNS in 120 min was significantly higher than that of the raw drug and physical mixture This simple lowcost miniaturization approach could prepare QTNS successfully， and could provide reference for the formulation of the nanosuspension.

[Key words]quercetin； nanosuspension； miniaturized milling method； in vitro release

槲皮素（quercetin，QT）为一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗癌、抗高血压、抗抑郁、镇静催眠等作用。但由于槲皮素亲水性差、吸收差、口服生物利用度低，限制了其临床应用[13]。

纳米混悬剂（nanosuspension，NS）是采用少量表面活性剂作为稳定剂的“纯药物”粒子所构成的一种亚微米胶体分散体系[4]。NS中药物以纳米状态存在，高度分散，利于药物的溶出和吸收，能显著提高药物的生物利用度。目前制备NS主要方法有“top down”和“bottom up”两类[5]，其中，介质研磨法作为常用“top down”技术已经实现了产品的上市。然而，现有的介质研磨法需要专门的研磨机，且一次制备所需原料药较多，处方及工艺筛选过程资源消耗较大，不适用于贵重原料药及新分离的活性化合物（分离量一般较少）的制备。

本研究参考文献方法[6]，设计一种微型化介质研磨技术，以磁力搅拌器为动力装置，西林瓶为研磨室，采用氧化锆珠子为研磨介质，制备QTNS，并对工艺进行优化。该方法一次制备只需要几十毫克的原料药，而且操作方便、不需专门的设备、成本极低。

1材料

集热式恒温加热磁力搅拌器（DF101S，北京恒丰长伟科技有限公司）；粒度/Zeta电位测定仪（Zetasizer Nano ZS，英国马尔文仪器有限公司）；智能溶出试验仪（ZRS8G，天津市天大天发科技有限公司）；紫外分光光度计（UV2401PC，日本岛津公司）。

槲皮素原料药（批号CY160517，陕西慈缘生物技术有限公司）；槲皮素对照品（批号100081201610，中国食品药品检定研究院）；泊洛沙姆188（P188，批号WPCH530B，北京风礼精求商贸有限责任公司）；无水乙醇（批号20160820，北京化工厂）。

2方法与结果

21QTNS的制备

采用微型化介质研磨法制备QTNS，称取80 mg P188于10 mL的西林瓶中，加入40 mL蒸餾水和磁力搅拌子，适当搅拌，混匀，加入QT 400 mg和粒径为04～06 mm氧化锆珠子（35，40，45 mL），通过调节磁力搅拌的转速（500，700，900 r·min-1），带动氧化锆珠子研磨不同时间（05，10，15 h）来制备QTNS。

22QTNS的粒径和多分散度指数的测定

取适量QTNS，加蒸馏水稀释，采用粒度/Zeta电位测定仪测定QTNS的粒径（PS）和多分散度指数（PDI），重复3次。

23QTNS的稳定系数的测定

取适量QTNS于20 mL EP管中，转速1 500 r·min-1，离心30 min[7]，取上层混悬液适量，加蒸馏水稀释，采用粒度/Zeta电位测定仪测量QTNS的粒径，重复3次。采用以下公式计算：稳定系数（SI）=离心后的PS/离心前的PS。

24QTNS工艺参数的优化

241BoxBehnken效应面法优化QTNS工艺本研究选择P188作为稳定剂，单因素试验（控制ZrO2的用量为35 mL，转速为700 r·min-1，研磨时间为05 h）结果表明，其用量对QTNS的PS，SI，PDI影响均较小，且用量为80 mg时，制得的QTNS的PS最小。P188用量单因素试验结果见表1。在参考文献和预实验基础上[89]，选择对QTNS制备较显著的3个因素，即ZrO2的用量（X1）、研磨速度（X2）和研磨时间（X3）进行优化研究。以PS（Y1，最小值为优）、PDI（Y2，最小值为优）、SI（Y3，接近1为优）为响应值，采用3因素3水平的BoxBehnken设计优化QTNS工艺。因素水平见表2，试验设计及结果见表3。

242模型拟合实验结果用DesignExpert 806软件进行二项式方程拟合，并将各因素对Y1，Y2，Y3进行相关性分析。回归系数的显著性检验见表4。删除对指标无显著性影响的项，得到的回归方程分别为Y1=422350-17350X1-217150X3+76200X32（R2=0983 8，校正R2=0962 9，P<0000 1）；Y2=0446-0038X1-0065X3（R2=0970 9，校正R2=0964 1，P<0000 1）；Y3=0798-7238×10-5X2+0552X3+2150×10-4X1X2-714×10-7X22-0123X32（R2=0989 0，校正R2=0974 9，P<0000 1）。

243工艺参数优化与预测根据回归方程，绘制以PS，PDI，SI对自变量的三维效应面图，结果见图1。由图1A可知，QTNS的PS受ZrO2的用量和研磨时间影响显著，随着ZrO2的用量增大和研磨时间的增加，PS都减小，而研磨时间对其影响较大；图1B表明，PDI随着ZrO2的用量增加和研磨时间的增大，都显著减小；图1C和图1D表明，所选的3个因素中研磨时间对SI的影响最为显著，研磨时间越长，ZrO2的用量越大，SI越大，而随着转速的增加，SI呈现先增大后减小的趋势。

244工艺验证采用DesignExpert 806实验设计软件，按Y1，Y2最小，Y3接近1设定目标，得到的最优工艺条件为X1=45 mL，X2=690 r·min-1，X3=15 h。模型对各指标的预测值Y1，Y2，Y3分别为169 nm，0191，0828。依据该工艺制备了3批QTNS，测定各响应指标。实际测量值分别（169±5） nm，0204±0006和0827±0014。结果显示，实际测量值与模型预测值接近，表明该模型的预测性良好。

25QTNS扫描电镜（SEM）观察

取最优的QTNS适量，蒸馏水稀释后，滴于锡箔纸上，常温条件下放置，挥干，制备QTNS的SEM样品，于SEM下观察其形态并拍摄照片，结果见图2。由图2可知，QT原料药大小不均匀，呈较大的棒

26Zeta电位测定

室温下，取QTNS适量，双蒸水稀释后，测定其Zeta电位，平行3次。测得Zeta电位为（-2390±939）mV，结果见图3。

27QT含量测定方法的建立

271对照品溶液及阴性溶液的制备精密称取QT对照品995 mg，22%乙醇配制成3980 mg·L-1的QT对照品储备液，于4 ℃冰箱中保存，备用。再称取一定量的P188，同法制得阴性溶液。

272测定波长的选择取适量QT对照品储备液，稀释为398 mg·L-1的QT对照品溶液，紫外分光光度计进行全波长扫描，发现在375 nm波长处有最大吸收。再取适量阴性溶液，于375 nm波长处扫描，发现无吸收峰，表明阴性无干扰。

273标准曲线的制备分别配制浓度为199，398，597，796，995 mg·L-1的QT对照品溶液，于375 nm处测定吸光度。以QT质量浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程C=0067A-0002，R2=0998。结果表明，QT在199～995 mg·L-1呈良好的线性关系。

28QTNS体外释放评价

参照《中国药典》2015年版第四部附录释放度测定方法：分别取QTNS、物理混合物混悬液、QT原料药混悬液各05 mL，以22%乙醇为释放介质，控制转速为50 r·min-1，温度为（37±05） ℃，分别于2，5，10，15，30，45，60，90，120 min取样50 mL，045 μm 微孔滤膜过滤并稀释，同时补充等温、等体积的22%乙醇，测定样品溶液吸光度，计算药物的体外累积释放度，平行3次。结果见表5，图4。由图可知，QTNS在30 min内，药物的体外累积释放度达到了（6767±407）%，而原料药和物理混合物的混悬液在120 min内的体外累积释放度仅分别为（3213±212）%和（3752±237）%，表明将QT制成QTNS，能显著提高其体外释放度。

3讨论

文献报道[5，10]，研磨介质用量、研磨速度和研磨时间是影响纳米混懸剂制备的主要因素。故本研究选择上述3个考察因素。NS具有热力学不稳定性，长时间放置，会出现粒子聚集等现象。故优化试验中，除了将常规的PS和PDI作为指标外，还引入了SI这一指标，考察其稳定性。

从体外累积释放度可知，QT原料药和物理混合物最大体外累积释放度只有35%左右，而制备成NS后，QT的体外累积释放度在30 min时就能达到65%以上，可见QTNS体外累积释放度明显优于QT原料药和物理混合物。分析原因可能是：NS使药物的粒径减小，表面积增大，药物的渗透性增强，从而使药物的饱和溶解度和溶出率都得到了提高[11]。

本研究中的实验器材容易获得，操作方便，而且节约原料药。总之，本研究设计的微型化介质研磨技术，可为纳米混悬剂的制备提供新的方法。

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[责任编辑孔晶晶]