肖乐天

研究背景

暑假，我到位于安徽省广德县的太极洞旅游。在参观洞区代表性景观之一壶天宫时，发现洞内钟乳石为黑褐色，十分突兀。询问导游、景区工作人员，他们也觉得很蹊跷，很可惜弄不清具体原因。景区已做了不少工作以清除这些污垢，但效果并不理想。不过，通过交流，我得知了一个事实：壶天宫内钟乳石早前也和其他溶洞内钟乳石一样呈现乳白色，但壶天宫后来曾被当作酒窖贮存原酒。不知是不是巧合，在贮酒一段时间后钟乳石表面开始出现一些黏稠的东西，颜色逐步加深，最终成为现在的样子（图1）。游览结束后，我一直在想，原本漂亮的钟乳石为什么会在窖酒后就变成黑褐色呢？这些黏稠黑褐色物质是怎么产生的？这一系列的问号激发了我深入探究的浓厚兴趣。

我首先在网上仔细搜索，发现与之有关的文献记录、研究资料都十分稀少。由于钟乳石颜色改变是在贮藏白酒原酒后发生的，因此我判断这可能是因贮藏白酒前后，洞内生态环境发生改变所致。通过实地采集样品、显微镜初步观察、微生物分离纯化等实验和分析，我初步判断壶天宫钟乳石变色是由溶洞生态环境改变引发微生物大量滋生导致的。

实验过程

黑褐色物质的采集

用无菌采样棉签挑取覆盖在钟乳石表面的黑褐色物质适量，转入无菌处理的采样瓶中，密封后低温保存于装有冰袋的保温盒内，带回实验室4℃保存备用。

黑褐色物质的初步显微观察

将黑褐色物质用无菌生理盐水适当稀释后，取100uL涂布在载玻片并置于载物台上；调节显微镜直至视野内看到清晰的物像，拍照记录；更换油镜，在要观察的位置上滴加1滴香柏油，再反复调节至看清楚标本止，拍照记录。

微生物的分离纯化

Luria-Bertani（LB）固体培养基平板的制备

分别称取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g，加蒸馏水定容至1L，于115℃高压灭菌30min。冷却至50℃左右后，在超净台上倒制平板，完成后存放于4℃冰箱备用。

微生物的分离培养及初步筛选

在超净工作台上称取适量黑褐色物质，加入1 mL无菌水，用移液器反复吹吸，直至样品混合均匀。取1000uL加到盛有9000uL无菌水的离心管内，稀释10倍制成稀释度为10的悬液。同法按每级稀释10倍的次序得到10、10的稀释液。用移液器分别吸取10、10、10倍稀释液100uL涂布于LB平板上，25℃倒置培养。

分離微生物的纯化

在超净工作台上，从涂布平板上选取大小和形态各不相同的单菌落，用接种环在其表面挑取少量菌体，在平板上划线。将划线后的LB平板放于25℃培养箱，倒置培养。

分离微生物的革兰氏染色及观察

先用草酸铵结晶紫进行初染，再用卢革式碘液媒染，然后用95%乙醇脱色，最后用番红溶液复染。用吸水纸吸掉载玻片上水膜，待染色标本干燥后置光学显微镜下观察，方法同上。

分离微生物菌株的保藏

用无菌牙签在分离良好的菌落表面挑取少许样品，投入装有LB培养液的试管中，盖上管塞，于25℃、200rpm振荡培养10h。用移液器吸取培养物850uL，加入盛有150uL无菌甘油的冷冻管中，混合均匀，置-70℃冷冻保藏。

分离菌株的透射电镜观察

取100uL培养24h后的菌液于无菌离心管中，滴加100uL2%磷酸钨染色液于样品中混匀。染色20min后，用铜网取样后晾干，交给教师放置于电镜样品室内进行观察照相。

实验结果

黑褐色物质特征

黑褐色样品外观黏稠，手感滑腻，有腐臭味。光学显微镜观察显示其中含有类似微生物细胞的深色不规则颗粒物和杆状物。

黑褐色物质稀释培养

在LB培养基中对黑褐色物质中的微生物进行了分离培养。结果显示，培养基上沿划线痕迹处形成了菌落，其分布由密集逐步稀疏，最后形成独立的单菌落。根据菌落形态大小的差异，我们分离获得了4株微生物，分别命名为H1、H2、H3和H4（见图2）。

分离菌株初步染色观察

对分离纯化的菌株进行革兰氏染色，经光学显微镜观察显示，4株菌株细胞形态各异，均显示为紫色，表明分离获得的菌株可能为来自不同种属的革兰氏阳性细菌。

透射电镜观察

与光学显微镜观察结果一致，透射电子显微镜观察结果显示4株细菌体外均被荚膜包裹（见图3），且部分菌株有长鞭毛。

讨论

太极洞景区的壶天宫曾被开发用于洞藏白酒原酒。然而，随着贮酒年份的增加，洞内钟乳石表面逐渐生成一层黏稠物质。随着时间延长，该物质的颜色发生变化，致使钟乳石由原初的乳白色变为黑褐色。如何修复受损的钟乳石成为景区亟待解决的难题。因此，探索壶天宫贮酒后钟乳石变黑成因，不仅可为该景点的修复提供理论依据，也可为其他溶洞资源的开发利用和保护管理提供科学指导。不同于相关溶洞中钟乳石污染的报道，在壶天宫用于贮藏白酒原酒的2年问，洞内钟乳石表层逐渐被一层黑褐色的黏稠物质包裹。可以推断，黑褐色物质的形成与贮酒行为直接相关。对钟乳石上黑褐色黏稠物质的显微镜检查结果显示，黏稠物质中包含少量细菌和疑似微生物细胞碎片物，提示黑褐色物质可能来源于微生物。然而，实验室培养条件下的微生物细胞及裂解物均为无色或其他颜色，并非目前所见的黑褐色黏稠物质。如果黑褐色物质来源于微生物，它们是怎样形成的呢？

结合溶洞的生态环境和观察的实验结果，推测黑褐色物质的形成过程如下：溶洞内环境相对封闭，经过长时间的自然修饰和适应，形成了稳定、独特的微生态环境，各种生物特别是微生物之间相互制约，处于平衡状态。在寡营养、高湿度、低气温条件下，溶洞内微生物生长缓慢，总量处于较低水平，覆盖在钟乳石表面的微生物及其裂解产物可被溶洞环境及时有效转化，或（和）被新形成的钟乳石覆盖，虽经几万甚至几十万年时间，钟乳石表面依旧呈现天然乳白色。

然而，当白酒原酒贮藏于相对封闭的溶洞后，酒坛内易挥发的酒精等物质就会逐渐扩散积累，浓度不断增大，加之高湿环境，大量的挥发物质随水蒸气凝结在洞内石山、石乳、石罩等之上，为微生物的生长提供了充足营养，导致某些类群的微生物大量过度繁殖；而另一些类群的微生物则逐渐处于劣势，甚至死亡，从而改变了原有微生物群落结构，微生物之间及微生物与环境之间的平衡遭到破坏。最终，由于过量繁殖的微生物及其裂解产物无法完全被环境转化，于是不断积累在钟乳石表面，其中含有的脂肪、碳水化合物等物质，在空气中氧的作用下，逐渐变黑，并与水混合，形成黑褐色黏稠物质。

该项目获得第30届全国青少年科技创新大赛创新成果竞赛项目中学组微生物学一等奖。

专家评语

该项目从开始的好奇探究到思考，符合中学生的思维和知识水平。研究内容合理，技术方法规范，有地方特色。建议利用分离的菌株进一步侵染钟乳石，模拟洞中的条件，以验证本项目分离鉴定出的微生物是否为钟乳石变色的原因。