赵佳玥, 张道勇, 潘响亮*

1.中国科学院新疆生态与地理研究所， 新疆干旱区环境污染与生态修复重点实验室， 新疆 乌鲁木齐 830011 2.浙江工业大学环境学院， 浙江 杭州 310014 3.中国科学院大学， 北京 100049

微米级核壳量子点团聚体在生物膜中的扩散与溶解及其毒性

赵佳玥1,3, 张道勇1,2, 潘响亮1,2*

1.中国科学院新疆生态与地理研究所， 新疆干旱区环境污染与生态修复重点实验室， 新疆 乌鲁木齐 830011 2.浙江工业大学环境学院， 浙江 杭州 310014 3.中国科学院大学， 北京 100049

包括量子点在内的人工纳米颗粒是近年来突出的环境污染物，为确定其在生物膜中的扩散过程和特征，应用TIRF(全内反射荧光)、FRAP(荧光漂白后恢复)等技术，研究了CdTeCdSZnS核壳式量子的微米级的团聚体在细菌Comamonastestoteroni生物膜表面的吸附动力学、生物膜内部的扩散及其在生物膜中的溶解和毒性. 结果表明：通过TIRF技术观察到生物膜可快速吸附>1 μm的CdTeCdSZnS核壳式量子点团聚体，而且通过CLSM(激光扫描共聚焦荧光显微镜)进行深度扫描发现，量子点团聚体吸附到生物膜表面后可以进一步扩散到生物膜深层，在25 min内可穿透45 μm的生物膜，并在生物膜中随深度呈线性分布特征. FRAP分析表明，量子点团聚体被生物膜固定后还具有较强的移动性，漂白区的荧光强度在5 min可恢复30%. 量子点团聚体在生物膜中会溶解产生Cd2+、Zn2+等重金属离子，从而对生物膜产生毒性并杀死细菌. 研究显示，虽然纳米颗粒进入环境中会形成微米级的团聚体，但依然可以进入生物膜，对水生微生物生态系统产生危害. TIRF、CLSM和FRAP技术是研究纳米颗粒物在生物膜表面吸附和内部扩散动力学的有效工具.

纳米颗粒； 量子点； 生物膜； 全内反射荧光(TIRF)； 荧光漂白后恢复(FRAP)

纳米颗粒是指粒径在三维空间内至少有一维小于100 nm的颗粒. 纳米颗粒具有显著的量子尺寸效应、界面效应、小尺寸效应等，在化工、医药、电子、环保等行业和日常生活用品中有着广泛的应用[1- 3]. 日益增多的应用也导致了越来越多的纳米材料进入到水、土环境介质中[4]，并对生物个体、群落和生态系统产生潜在风险[5- 6].

生物膜是一种或多种微生物附着于固体表面的微生物聚集体[7- 8]，主要由EPS(胞外聚合物)及包埋其中的细胞组成[9- 10]，在水环境中普遍存在，在元素的生物地球化学循环、污染物净化等方面起重要作用[11- 15]. 现有的一些研究表明纳米颗粒(如纳米银、ZnO、CuO等)对细菌生物膜有明显的抑制和毒害作用[16- 20]. 虽然有相当多的纳米颗粒对生物膜毒性的报道，也有不少关于生物膜对多孔介质中纳米颗粒的迁移的影响研究[21- 23]，但是关于纳米颗粒在生物膜表面的吸附、在生物膜中的扩散和穿透效率以及在生物膜中的溶解性的研究还很有限，而这些信息对于深入了解纳米颗粒对生物膜的毒性机理是至关重要的. 少量研究表明，纳米颗粒在生物膜中的扩散与纳米颗粒的粒度和表面电荷[24]、EPS密度和细菌细胞壁性质等相关[25]. 在这些研究中，采用的都是分散良好的纳米颗粒. 而事实上当纳米颗粒进入水环境后很容易形成数百nm到μm级的团聚体. 然而，这些微米级的纳米颗粒团聚体进入生物膜、在生物膜中的行为及毒性并不清楚.

TIRF(全内反射荧光)显微镜是利用全内反射产生的消逝波激发荧光物质的显微镜. TIRF只能激发样品表面数百nm(通常小于200 nm)厚的薄层内的荧光物质，而这个范围外的发荧光物质则完全不受影响，因此TIRF技术信噪比高，细胞的光损伤和漂白都很小. 经常被用于界面的吸附及细胞膜过程的研究[26- 28].

FRAP(光漂白后荧光恢复)技术是利用高强度的激光在短时间内将一定区域内的荧光漂白，然后检测该区域内荧光强度的恢复过程. 而漂白区域的荧光恢复来源于区域外的荧光物质向漂白区域扩散的结果，因而FRAP被广泛应用于活细胞、膜、凝胶等体系中物质的扩散速率[29].

由于量子点是三个维度的尺寸都小于100 nm准零维的纳米颗粒，在生物医药和半导体器件中大量应用，而且在激发光下可以释放荧光，便于可视化观测纳米颗粒在生物膜中的空间分布，也因此经常被用作模式纳米颗粒研究纳米颗粒的环境行为. 因此该研究以量子点作为测试用的纳米材料. 应用TIRF、CLSM(激光扫描共聚焦荧光显微镜)以及FRAP技术研究了微米级的纳米颗粒CdTeCdSZnS核壳式量子点团聚体在单一种生物膜中的吸附、扩散、溶解性及其对生物膜的毒性，以深入了解纳米颗粒在水-生物膜系统中的行为和影响，并为纳米颗粒的生态毒理学提供新的研究手段和方法.

1 材料与方法

1.2 生物膜

试验用的细菌Comamonastestoteroni由中国科学院新疆生态与地理研究所刘文博士提供. 将灭菌后的细胞爬片浸入C.testoteroni细胞密度为0.60～0.70的液体营养肉汤(LB)培养基中，在25 ℃培养12 h后取出细胞爬片，用去离子水将生物膜表面的培养基冲洗干净，即刻用于TIRF试验；细菌用培养皿培养24 h后用去离子水冲洗干净后进行CLSM试验.

1.3 生物膜对量子点的吸附和扩散的TIRF试验

TIRF成像系统由X81倒置显微镜(日本，东京奥林巴斯)，TIRF专用数值孔径为1.49的60×油浸物镜(日本，东京奥林巴斯)，EMCCD(英国Belfast，安道尔iXon DU860-D)和405 nm固体激光器组成. 测试过程中激光强度为3.5%. 将培养12 h的长有生物膜的细胞爬片倒扣在有150 μL 10 mmolL KCl溶液的培养皿底部，加入25 μL 50 mgL CdTeCdSZnS核壳式量子点溶液，并立刻进行10 fps的速率TIRF成像，记录生物膜表面的量子点荧光强度随时间的变化[30].

1.4 量子点在生物膜不同深度扩散的CLSM试验

1.5 FRAP试验

将吸附了量子点2.5 h后的生物膜样品进行FRAP测试. 选择量子点荧光分布均匀的区域，用100%强度的405 nm激光将半径为3.5 μm的ROI(圆形测试区域)荧光漂白5 s，记录ROI随时间的荧光强度[31- 32].

1.6 生物膜细菌死活测试

1.7 生物膜细胞内中重金属离子浓度动态观测

生物膜中Cd2+的浓度用Phen Green SK diacetate (PG SK) (Life Technologies, P14313, Grand Island, NY, USA)探针标记. 先将PG SK探针溶于少量DMSO(二甲基亚砜)中，然后用Hank平衡盐溶液(HBSS)稀释. PG SK绿色荧光重金属探针可以用来检测生物膜中Cu2+、Cu+、Fe2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Zn2+和Ni2+的浓度. 由于试验中没有人为加入Cu2+、Hg2+、Pb2+等重金属离子，加入的是CdTeCdSZnS核壳式量子点，因此基本上可用来表征生物膜中

Cd2+和Zn2+浓度. 将吸附量子点2、24、48、72 h后的生物膜用10 μmolL PG_SK探针在黑暗中25 ℃染色10 min，用HBSS洗去多余的探针后进行CLSM观测[34]. PG SK探针的λExλEm为488 nm500～530 nm.

1.8 统计分析

所有的试验至少重复3次，数值类结果均用平均值和标准差表示.

2 结果与分析

图1 TIRF记录的生物膜吸附CdTeCdSZnS核壳式量子点Fig.1 Adsorption process in biofilms of CdTeCdSZnS Core-Shell-Shell Quantum Dots by TIRF

图2则可直观地观察到量子点团聚体随时间在生物膜中的扩散分布过程，结果与TIRF的数据一致，并且表明μm级的量子点团聚体可以在较短的时间内穿透45 μm厚的生物膜. 由图3可见，在10 mmolL KCl溶液中生物膜不同深度CdTeCdSZnS核壳式量子点荧光强度总体上在40 min达到吸附平衡，然后随时间稍有增加；总体上荧光强度随深度逐渐变弱，说明量子点团聚体在生物膜不同深度存在浓度梯度，也说明量子点与生物膜EPS中的组分有较为紧密的结合，或者是量子点进入了细菌细胞中. 量子点可以通过内吞作用的小囊泡、气孔间扩散作用或者电子传递系统进入细菌的磷脂双分子层[35].

图2 生物膜吸附CdTeCdSZnS核壳式量子点不同时间的3D荧光图像Fig.2 3D fluorescence images of CdTeCdSZnS Core-Shell-Shell Quantum Dots adsorbed to biofilms at different time

生物膜深度μm：1—0；2—2.5；3—5.0；4—7.5；5—10.0；6—12.5；7—15.0；8—17.5；9—20.0；10—22.5；11—25.图3 生物膜不同深度CdTeCdSZnS核壳式量子点荧光强度随时间的变化Fig.3 The change with time of fluorescence intensity of CdTeCdSZnS Core-Shell-Shell Quantum Dots at different depth

注:荧光漂白和恢复区域为3.5 μm的圆形. 图4 CdTeCdSZnS核壳式量子点在生物膜中典型的FRAP曲线及其一阶指数增长方程拟合Fig.4 Typical FRAP curves of CdTeCdSZnS Core-Shell-Shell Quantum Dots in biofilms and fitting of the FRAP data using the exponential growth model

图5 CdTeCdSZnS核壳式量子点团聚体加入到生物膜中不同时间后细胞内重金属离子的荧光强度 Fig.5 Fluorescence intensity of intracellular heavy metal ions in biofilms

图6 生物膜活细胞荧光成像Fig.6 Fluorescence images of living cells in biofilms

3 讨论

生物膜在河流、湖泊、地下水、土壤及供水管道等环境中无处不在. 当纳米颗粒进入环境介质后会难以避免地与生物膜接触. 生物膜由各种各样的微生物细胞、蛋白质、多糖及DNA等物质组成，表面物理化学性质各异，因此生物膜会影响纳米颗粒在环境中的迁移甚至转化. 而要了解生物膜对纳米颗粒迁移的影响，测定纳米颗粒在生物膜表面的吸附过程是非常重要的. 该研究应用TIRF技术实时在线监测了CdTeCdSZnS核壳式量子点团聚体在C.testoteroni生物膜表面的吸附动力学，发现在KCl溶液中C.testoteroni生物膜可以非常迅速地吸附CdTeCdSZnS核壳式量子点团聚体(见图1). 该结果可以用来解释最近发表的许多关于环境中的生物膜可以改变石墨烯氧化物、聚苯乙烯纳米颗粒、ZnO、量子点等纳米颗粒在沙土和多孔介质中的迁移性(主要为滞留效应)[21- 23].

虽然越来越多的研究发现，生物膜可以阻碍纳米颗粒的迁移，但是关于纳米颗粒是否容易在生物膜内部扩散则还不清楚. 通过CLSM深度扫描的重建图像清楚地观察到即使是微米级的量子点也可以迅速地往生物膜深层扩散(见图2). 量子点扩散到生物膜各个微层的扩散动力学遵守指数增长规律，而量子点扩散后从表层到深层，在空间上则基本上呈线性分布(见图3). FRAP试验也表明量子点进入生物膜后还具有一定的扩散能力(见图4). 有限的研究也表明纳米颗粒可以在生物膜内扩散. 葡聚糖、微球、银等纳米颗粒可以在Pseudomonasfluorescens生物膜中扩散，但受生物膜结构、EPS、细胞、纳米颗粒大小和表面电荷控制，其相对自扩散速率随纳米颗粒半径的平方值增大而呈指数下降[36]. 不过已报道的生物膜中纳米颗粒的扩散大多是非团聚的颗粒，我们的研究则发现微米级的纳米颗粒团聚体也可扩散进入生物膜内部，但是团聚体在进入生物膜内部时是否分散开则需要进一步研究.

另外，该研究也表明，TIRF是一种直接便利地研究生物膜表面吸附纳米颗粒动力学过程的可视化技术手段，而且从TIRF曲线下降部分的曲线可以解读纳米颗粒在生物膜内的扩散过程，这些信息与CLSM的Z轴扫描数据相互补充.

4 结论

b) 量子点团聚体对生物膜具有一定的毒害作用，量子点加入后生物膜中活细胞荧光强度降低50%. 量子点溶解后产生的重金属离子会加大对生物膜的毒性. 虽然纳米颗粒进入环境中会形成微米级的团聚体，但依然可以进入生物膜，对水生微生物生态系统产生危害.

c) TIRF、CLSM和FRAP技术是研究纳米颗粒物在生物膜表面吸附和内部扩散动力学的有效工具.

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Diffusion and Toxicity of Micrometer CdTe/CdS/ZnS Core-Shell-Shell Quantum Dot Aggregates in Biofilm

ZHAO Jiayue1,3, ZHANG Daoyong1,2, PAN Xiangliang1,2*

1.Xinjiang Key Laboratory of Environmental Pollution and Bioremediation, Xinjiang Institute of Ecology and Geography, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, China 2.College of Environment, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China 3.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Nanoparticles including quantum dots are emerging pollutants. Adsorption and subsequent diffusion of nanoparticles in biofilm are still not well known. Adsorption kinetics, diffusion, dissolution and toxicity of the micrometer-size aggregates of the model nanoparticles, CdTeCdSZnS core-shell-shell quantum dot (QD), inComamonastestoteronibiofilm were investigated using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) and Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). It was demonstrated thatC.testoteronicould adsorb aggregates of CdTeCdSZnS QDs (>1 μm), and could further diffuse into deeper layers of the biofilm and penetrate the 45 μm thick biofilm within 25 mins. The amount of accumulated QDs in microlayers of the biofilm decreased linearly with depth. The FRAP results showed that about 30% fluorescence intensity recovered within 5 min, indicating the mobility of QDs in the biofilm. The QDs dissolved in the biofilm and thus released heavy metals and exerted toxic effects on the biofilm. The results revealed that nanoparticles can penetrate into the biofilm and posed a great risk to aquatic ecosystems, although they may aggregate in the aquatic environment. TIRF, CLSM and FRAP are convenient and powerful tools for characterizing adsorption and diffusion of nanoparticles in biofilm.

nanoparticles; quantum dots; biofilm; total internal reflection fluorescence (TIRF); fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)

2016-12-29

2017-05-01

中国科学院“百人计划”项目

赵佳玥(1991-)，女，北京人，jiayue_zhao@hotmail.com.

*责任作者，潘响亮(1972-)，男，浙江东阳人，教授，博士，博导，从事生态毒理与环境修复研究，panxl@zjut.edu.cn

X52

1001- 6929(2017)08- 1303- 07

A

10.13198j.issn.1001- 6929.2017.02.50

赵佳玥,张道勇,潘响亮.微米级核壳量子点团聚体在生物膜中的扩散与溶解及其毒性[J].环境科学研究,2017,30(8):1303- 1309.

ZHAO Jiayue,ZHANG Daoyong,PAN Xiangliang.Diffusion and toxicity of micrometer CdTe/CdS/ZnS core-shell-shell quantum dot aggregates in biofilm[J].Research of Environmental Sciences,2017,30(8):1303- 1309.