孟蕾，周红霞，李慧素，彭丽，马浩轩，吴宁鹏*

(1.河南省兽药监察所，郑州 450008；2.郑州市第七中学，郑州 450008)



高效液相色谱法测定饲料中七种水溶性色素

孟蕾1，周红霞1，李慧素1，彭丽1，马浩轩2，吴宁鹏1*

(1.河南省兽药监察所，郑州 450008；2.郑州市第七中学，郑州 450008)

应用高效液相色谱法建立了饲料中柠檬黄、桔黄、胭脂红、食品红、苋菜红、亮蓝、靛蓝7种水溶性色素测定的新方法。样品经40 mL乙腈-丙二醇-水-氨水(25∶5∶19∶1)两次提取，PWAX柱净化处理后，以0.02 mol/L乙酸铵溶液(pH=5.0)-乙腈为流动相进行梯度洗脱，7种水溶性色素经C18柱得到良好分离。7种水溶性色素在0.5(1.0) ～ 50 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数均不小于0.999。亮蓝的检出限为0.25 mg/kg，定量限为0.5 mg/kg；柠檬黄、苋菜红、胭脂红、桔黄、食品红的检出限为0.5 mg/kg，定量限为1.0 mg/kg；靛蓝的检出限为1.0 mg/kg，定量限为2.0 mg/kg。饲料样品在定量限、低、中、高4个加标浓度下，7种水溶性色素的回收率为60.6%～116.1%，相对标准偏差为0.9%～7.3%，结果表明方法适用于饲料中7种水溶性色素的检测要求。该方法操作简单、准确、杂质干扰少。

水溶性色素；饲料；高效液相色谱

近年来人工合成色素因其廉价、高效、上色效果好被广泛应用于食品添加剂中，这类色素包括柠檬黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝等。除了作为食品添加剂使用之外，一些不法分子为了提高饲料的色泽，将这类色素添加到饲料中以谋取不法利益。我国农业部公告第2045号公告《饲料添加剂品种目录(2013)》中对可使用色素的种类有明确规定，允许添加到家禽的色素有β-胡萝卜素、辣椒红、β-阿朴-8′-胡萝卜素醛、β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯、β，β-胡萝卜素-4，4-二酮(斑蝥黄)、天然叶黄素，而常见的人工合成色素柠檬黄、日落黄、诱惑红、胭脂红、靛蓝、食品红、苋菜红、亮蓝仅允许添加至宠物、观赏鱼饲料中。违禁、违规色素在饲料中的添加不同于天然色素，会给消费者的健康带来一定的风险和危害[1]。为了保障消费者的食品安全，建立一种快速有效的同时检测饲料中多种人工合成水溶性色素的分析方法具有重大意义。目前，有关人工合成水溶性色素检测的报道很多，但是研究的基质多为化妆品[2]、饮料[3-6]、肉类食品[7-8]等，关于饲料基质中水溶性色素的报道鲜有。根据已有报道，水溶性色素的检测方法主要有毛细管电泳法，薄层色谱法、电化学法、液相色谱法[5，7，9-10]和液质联用法[4，8，11]。净化处理主要为直接稀释法[3-6]、聚酰胺吸附法[12-14]和固相萃取法[6，8，11，15]。本文选用PWAX弱阴离子交换柱净化样品，高效液相色谱法同时测定七种色素，方法简便、快捷、灵敏、准确。

1 材料和方法

1.1 仪器 高效液相色谱仪，配紫外检测器 (美国Waters公司)；分析天平(感量0.01 g)；METTLE TOLEDO XP205电子分析天平(感量0.01 mg，梅特勒-托利多仪器公司)；KQ3200E超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)；台式高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；N-EVAP-112氮气吹干仪 (美国Organomation Associates Jnc公司)。

1.2 试剂 乙酸铵(色谱纯，德国Sigma公司)，乙腈(色谱纯，德国Sigma公司)，丙二醇(天津、科密欧公司)，氨水(北京化工厂)，乙酸(北京化工厂)为分析纯；实验用水为经Milli-Q净化系统 (美国Millipore公司) 制备的去离子水。柠檬黄(纯度88%)、桔黄(纯度90%)、食品红(纯度80%)、胭脂红(纯度70%)、苋菜红(纯度94.7%)、亮蓝(纯度98%)、靛蓝(纯度91%)，均购于Dr. Ehrenstorfer公司。

1.3 标准溶液的配制 分别精密称取柠檬黄、苋菜红、胭脂红、靛蓝、亮蓝、桔黄、食品红标准品适量，置10 mL容量瓶中，用水稀释定容，分别配制成1.0 mg/mL的标准储备液。根据不同的添加浓度用水分别将其稀释成相应的标准工作溶液。

1.4 试验方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18柱，250 mm×4.6 mm，填料粒径为5.0 μm；流动相A为0.02 mol/L乙酸铵溶液(pH=5.0)，流动相B为乙腈溶液。梯度洗脱，波长变化和梯度洗脱条件见表1和表2；检测波长为425、500、630 nm；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。

表1 波长变化

表2 梯度洗脱条件

1.4.2 样品前处理 称取试样2 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，准确加入提取液乙腈-丙二醇-水-氨水(25∶5∶19∶1)20.0 mL，涡旋混合后，震荡10 min，水浴超声提取10 min。10000 r/min离心10 min，移取上清液至另一50 mL离心管中。残渣中再次加入20.0 mL提取液重复提取一次，合并上清液。准确移取上清液10.0 mL于另一离心管中，加入20.0 mL水，用甲酸调至pH=2.0(±0.2)，混匀后，备用。

PWAX固相萃取柱依次用甲醇和水各5 mL活化，2%甲酸溶液5 mL平衡，将备用液全部过柱。依次用2%甲酸溶液、80%甲醇(1%甲酸水)溶液、甲醇各5 mL淋洗，抽干。10%氨化甲醇溶液5 mL洗脱，收集洗脱液，40 ℃下氮气吹干。准确加入水500 μL溶解残余物，涡动混匀，超声10 min，过0.22 μm 微孔滤膜，供HPLC测定。

2 结果与分析

2.1 方法的线性范围及灵敏度 准确量取标准工作溶液适量，用水稀释，亮蓝制得0.5，1.0，2.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列标准溶液，其它色素用水稀释成浓度为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列标准溶液，由低浓度到高浓度供高效液相色谱仪测定。以色谱峰面积比率为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，如表3所示。

空白试样按相同步骤处理上机测定后，以信噪比S/N>10计算得到亮蓝定量限为0.5 mg/kg，柠檬黄、苋菜红、胭脂红、桔黄、食品红的定量限为1.0 mg/kg，靛蓝的定量限为2.0 mg/kg。以信噪比S/N>3计算得到亮蓝检测限为0.25 mg/kg，柠檬黄、苋菜红、胭脂红、桔黄、食品红的检测限为0.5 mg/kg，靛蓝的检测限为1.0 mg/kg。

表3 7种水溶性色素的回归方程及相关系数

2.2 方法的准确度及精密度 结合方法的灵敏度等因素，确定方法在配合料、浓缩料中的添加浓度分别为LOQ(靛蓝为2 mg/kg、亮蓝为0.5 mg/kg、其他色素为1.0 mg/kg)，5，10和100 mg/kg。每个浓度做5次平行，连续测定3 d，各化合物的回收率及批内、批间相对标准偏差(RSD)如表4、表5所示，7种水溶性色素的回收率为60.6%～116.1%，相对标准偏差为0.9%～7.3%，本方法显示了良好的准确度、精密度和重现性。各色素在配合料中的空白色谱图见图1。空白配合料加标的色谱图见图2。标准溶液的色谱图见图3。

3 讨论与小结

3.1 液相条件优化

3.1.1 检测波长的确定 用水稀释七种水溶性色素至10 μg/mL的溶液，进行紫外全扫描，确定每种色素的最大波长。结合可见光波段杂质干扰少和各组分灵敏度两个因素，选择425、500、630 nm作为七种水溶性色素的检测波长。

3.1.2 流动相的确定 本试验选择AglientZorbax Eclipse Plus C18(4.6×250 mm，5 μm)作为色谱柱，参考文献，有机相考察了乙腈和甲醇，水相考察了不同浓度的乙酸铵溶液[8-9](5、10、20、50 mM)，通过比较，结果发现当水相使用20 mM乙酸铵，pH至调至5.0时，七种水溶性色素峰型较好，无明显拖尾现象；有机相使用乙腈时柱压更低，因此选择乙腈-20 mM乙酸铵(pH=5.0)作为流动相。

表4 浓缩料基质中7种水溶性色素的回收率及相对标准偏差(n=5)

表5 配合料基质中7种水溶性色素的回收率及相对标准偏差(n=5)

续表

3.2 样品提取条件的优化 参考已报道的文献，提取水溶性色素使用的提取液有水[7]、乙醇：水(1∶1，V/V)[5]，乙醇∶氨水∶水(7∶2∶1，V/V/V)[2-5]，乙醇∶氨水∶水(80∶1∶19，V/V/V)[4]。首先尝试使用纯水相提取饲料，但饲料基质中含有大量淀粉、蛋白质和脂肪，提取溶液混浊，无法净化，因此在提取液中加入一定比例的有机相。尝试使用了乙醇、甲醇和乙腈这三种有机试剂，并将机相比例提高至50%、60%、70%、80%，比较结果发现使用60%乙腈作为提取液较为理想。同时还考察了提取液酸碱性对色素提取效率的影响，结果表明在碱性条件下色素的回收率更高，分别考察了2%和5%的氨水，两者提取效果差异不大，但2%氨水更有利于净化步骤调节pH值，因此初步将提取液定为乙腈：水：氨水=30∶19∶1(V∶V∶V)。随后又对配合饲料和浓缩饲料都进行了添加回收试验，但浓缩饲料中靛蓝回收率低，考虑靛蓝易溶于丙二醇，分别加入了5%和10%丙二醇溶液，结果表明10%的丙二醇有效提高了靛蓝的回收率，最终提取液优化为乙腈∶丙二醇∶水∶氨水=25∶5∶19∶1(V∶V∶V∶V)。

3.3 净化条件的优化 本实验比较了弱阴离子交换柱[8,16]PWAX、C18[6]、HLB和PEP-2固相萃取柱对七种水溶性色素的回收率，实验结果见表4。PWAX柱、HLB柱和PEP-2柱回收率均可以，但是一方面由于提取液有机相比例较高，过HLB和PEP-2柱之前需稀释或浓缩提取液来改变溶剂的类型，提取液一经浓缩就变的非常混浊，无法过柱，若通过稀释需要加入大量稀释液，过柱将花费大量时间；另一方面，HLB柱和PEP-2柱专属性不强，对饲料净化效果差，因此选择了回收率好，专属性强的PWAX柱。

图1 空白配合饲料色谱图

图2 空白添加配合饲料色谱图(靛蓝为2 mg/kg、亮蓝为0.5 mg/kg、其他色素为1.0 mg/kg)

图3 标准溶液的色谱图(靛蓝为2 mg/kg、亮蓝为0.5 mg/kg、其他色素为1.0 mg/kg)

化合物名称PWAX/%C18/%HLB/%PEP-2/%柠檬黄95.284.697.998.3苋菜红95.775.396.493.9靛蓝10094.198.6107.8胭脂红93.372.997.496.8桔黄96.991.998.897.9食品红101.592.598.9103.5亮蓝9491.498.192.8

PWAX柱为弱阴离子交换柱，色素在酸性条件下在柱子上有较好的保留，因此需要优化提取液的pH值，同时为了保证上样液合适的离子强度，首先对提取液进行稀释，取10 mL提取液，加入20 mL水和一定量甲酸，将上样液pH调至2、3、4、5、6进行测定，当pH值大于等于3时，亮蓝已有较大的损失，因此加入甲酸(约3.2 mL)将上样液pH调至2左右。同时也对淋洗液和洗脱液进行了优化，淋洗液为5 mL 2%甲酸溶液，5 mL 80%甲醇(1%甲酸水)，5 mL甲醇。洗脱液为5 mL 10%氨化甲醇。

本方法基于高效液相色谱法，利用弱阴离子交换柱净化饲料中的杂质，建立了测定饲料中7种水溶性色素的液相色谱法，确定了提取净化条件以及液相色谱条件，显示了较好的准确度和精密度，满足饲料中7种水溶性饲料的检测要求。

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(编辑：侯向辉)

Simultaneous Determination of 7 Kinds of Water-soluble Pigments in Feeds by High Performance Liquid Chromatography

MENG Lei1，ZHOU Hong-xia1，LI Hui-su1，PENG Li1，MA Hao-xuan2，WU Ning-peng1*

(1.HenanInstituteofVeterinaryDrugControl,Zhengzhou450008，China；2.ZhengzhouNo.7MiddleSchool,Zhengzhou450008，China)

WUNing-peng,E-mail:wnppeking2002@163.com

A method based on high performance liquid chromatography was developed for quantitative analysis of 7 kinds of water-soluble pigments in feeds. The conditions of sample preparation and analysis were optimized in this thesis. The pigments were firstly extracted with 40 mL of acetonitrile-propanediol-water-ammonia water (25∶5∶19∶1)by twice and purified by PWAX SPE column.A HPLC separation was carried on an Agilent-C18 column (4.6 mm×250 mm，5 μm) with the mobile phase of acetonitrile-0.02 mol/L ammonium(pH=5.0) for gradient elution and detected using a UV detector at 425 nm，500 nm，630 nm. The method was quantified by the external standard method and the linear ranges for 7 kinds of pigments were in the range of 0.5(1.0)-50 μg/mL with correlation coefficients greater than 0.999. The average recoveries ranged from 60.6% to 116.1% of 7 kinds of pigments in feeds at four different levels withRSDless than 7.3%.The limits of detection were 0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，1.0 mg/kg and the limits of quantitation were 0.5mg/kg，1.0 mg/kg，2.0 mg/kg. The results indicated that the method developed was highly sensitive and selective in determination of 7 kinds of water-soluble pigments in feeds.

water-soluble pigments；feeds；high performance liquid chromatography

2016年国家畜禽产品未知危害因子识别与已知危害因子安全性评估项目(GJFP2016007) 作者简介： 孟蕾，硕士研究生，从事饲料兽药质量检测工作。

吴宁鹏。E-mail：wnppeking2002@163.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.07

2016-10-11

A

1002-1280 (2017) 07-0034-08

S859.2