黄 振，董卫国

(武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060)

检测人血清中5-羟色胺的高效液相色谱-串联质谱技术方法

黄 振，董卫国

(武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060)

目的 建立一种快速、灵敏地测定血清中5-羟色胺的高效液相色谱-串联质谱技术方法(LC-MS/MS)。方法采用同位素内标稀释法，直接沉淀蛋白，采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×50 mm，3.5 μm)，大气压化学电离源(APCI)，正离子模式，选择5-HT的特征离子对177.1/160.0，内标d4-5-HT的特征离子对181.1/164.0。结果5-HT在10～2000 ng/ml浓度范围内线性关系良好(r=0.9996)，定量下限为10 ng/ml，提取回收率＞85%，日内和日间精密度＜15%。结论本LC-MS/MS技术方法准确可靠、重现性好，灵敏度高，适用于人血清样品中5-HT的浓度测定。

5-羟色胺;血清;高效液相色谱-串联质谱

5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)由色氨酸经色氨酸羟化酶催化首先生成5-羟色氨酸，再经5-羟色氨酸脱羧酶催化形成，最早是从血清中发现的，又名血清素，由吲哚和乙胺两部分组成，是一种重要的生物胺，分子式C10H12N20，在20世纪40年代末期首次从血清中分离出一种缩血管物质并将之命名为血清紧张素，1949年将其确定为5-HT。人体内95%的5-HT在胃肠道的肠嗜铬细胞及肠神经元中合成，嗜铬细胞受肠腔内压力和化学物质刺激时通过旁分泌、腔内分泌、内分泌途径释放5-HT至血液，周围组织和肠腔［1～3］。5-HT在人体中既是重要的神经递质也是外周调质，参与许多生理和病理过程，如胃肠道的运动、血小板的变形、刺激血管的收缩和舒张、中枢和周围神经系统功能以及内分泌调节等。类癌瘤综合症、精神分裂症、厌食症、焦虑症、抑郁症、阿尔茨海默病、帕金森病、药物引起的呕吐、高血压、偏头痛、雷诺病，心律失常等疾病常伴有5-HT 的代谢异常［4～7］。因此，对血清中的 5-HT 进行含量检测，对多种疾病的诊断和治疗有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂Q Exactive高分辨液相色谱-质谱联用仪、Thermo四元泵系统、CTC自动进样系统、VORTE XKB-3旋涡混合器、BSA223 S分析天平、Eppendorf-5810R高速台式离心机，Milli-Q Reference超纯水仪。5-羟色氨(购自 Sigma公司，批号BCBG1337 V)、氘代5-羟色胺(购自CDN Isotopes公司，批号E344P59)、全氟戊酸(购自 Sigma公司，批号MKBN4540 V)、血清(购自 Sigma公司，批号H4522)、甲醇(色谱纯)购自美国Fisher公司，实验室用水为Milli-Q超纯水。

1.2 色谱和质谱条件色谱柱为Agilent Zorbax E-clipse XDB-C18柱(4.6 mm×50 mm，3.5 μm，批号LAAJ-93597-902)、流动相:1.25 mM全氟戊酸水溶液-甲醇溶液、柱温:40℃、流速0.3 ml/min、进样量10 μl;采用梯度洗脱程序，各段时间内流动相比例及流速变化，见表1。离子源为大气压化学电离源(APCI)、全离子扫描范围300～2000 m/z、归一化碰撞能量35、鞘气流速20，辅助气流速5，吹扫气流速0，毛细管温度250℃，APCI气化室温度250℃。

1.3 标准溶液的制备精密称取5-HT及其同位素内标d4-5-HT对照品10 mg于10 ml量瓶中，加甲醇-水(80/20，v/v)的溶液溶解并稀释定容，配制成1 mg/ml的5-羟色胺及其内标储备液。分别取适量1 mg/ml的5-HT及其同位素内标d4-5-HT储备液用甲醇-水(80/20，v/v)稀释成浓度分别为20 μg/ml和100 ng/ml的工作液。分别取适量的工作液，用空白血清稀释至标准曲线所需的浓度，配制成相当于 5-HT 血清浓度分别为 10、20、50、100、200、500、1000、2000 ng/ml的标准系列溶液;分别取适量工作液，用空白血清稀释至质控样本所需的浓度，配制成相当于5-HT血清浓度分别为30、200、1600 ng/ml的低、中、高质控溶液。

表1 5-HT的梯度洗脱

1.4 血清样本的处理取若干1.5 mlEP管，编号后精密吸取50 μl待测血清样本，加入450 μl d4-5-HT溶液;立即涡旋混合30 s，室温下放置5 min;再次涡混10 s，以10000 rpm转速离心5 min;取上清液100 μl，加入 100 μl甲醇-水(80/20，v/v)，涡混 30 s，吸取10 μl进行LC-MS/MS分析。

1.5 基质效应计算取50 μl空白血浆，除不加内标溶液外，按“1.4血血浆样品处理”项下操作，每一浓度进行5个样本分析，然后向100 μl的上清液中分别加入 100 μl 低、中、高浓度(30、200、1600 ng/ml)的5-HT和d4-5-HT溶液，涡流混合，取10 μl进样分析，所获得的峰面积(五次测定的平均值)记为Ci。另取5-HT标准溶液和d4-5-HT溶液，用流动相稀释成相同浓度的标准溶液，每一浓度进行5个样本分析，同样取10 μl进样分析，所获得的峰面积(三次测定的平均值)记为Ai，基质效应(ME)=Ci/Ai ×100%［8，9］。

1.6 精确度及准确度测定按“1.3标准溶液的制备”的方法配制低、中、高三个浓度的质控(QC)样品(5-HT的血清浓度分别为30、200、1600 ng/ml)，每一浓度进行5样本分析，连续测定三天，根据当日的标准曲线，计算QC样品的检测浓度。

1.7 稳定性测定本实验考察了5-HT血清样品室温放置3 h，经沉淀蛋白处理后在室温放置20 h，以及5-HT血清样品经历3次冷冻－解冻循环，血清样品冷冻(－20°C)放置45天的稳定性。按“1.3标准溶液的制备”项下配制的低、高两个浓度的血清样品(5-HT的血清浓度分别为30、1600 ng/ml)，每一浓度进行3样本分析，采用LC/MS/MS法来测定。

1.8 提取回收率的测定取空白血清 50 μl，按“1.3标准溶液的制备”项下操作，配制低、中、高三个浓度的样品(5-HT的血清浓度分别为30、200、1600 ng/ml)，每一浓度进行5样本分析，进样体积为10 μl，所获得的峰面积记为Bi。同时另取50 μl空白血清，其余操作同“1.5基质效应”的方法操作所得的峰面积记为Ci，提取回收率=Bi/Ci×100%。

2 结果

2.1 方法的特异性对已知的化合物5-HT及其同位素内标d4-5-HT，在设定的条件下，经过多次扫描比较，选定5-HT(m/z)的离子对为:177.13725→160.07448，d4-5-HT(m/z)的离子:181.12094 →164.09955。其二级全扫描质谱图，如图1。在此离子对的基础上，分别得到空白血清、空白血清添加标准系列溶液以及受试者的血清样本的色谱图，如图2;5-HT及d4-5-HT的出峰时间，即保留时间约为1.3 min，峰形良好，无内源性物质干扰，显示出该方法条件下的5-HT及d4-5-HT的特异性好。

2.2 标准曲线及定量下限检测得到10、20、50、100、200、500、1000、2000 ng/ml的系列浓度血清溶液的5-HT及相应内标的峰面积，以血清中5-HT的浓度为横坐标(X)，待测物质峰与内标峰面积比值为纵坐标(Y)，用加权(W=1/X)最小二乘法进行回归运算，得直线回归方程及其相关系数为:Y=0.00039818X-0.000715379，r=0.9996，建立了 5-HT的标准曲线，如图3。结果表明血清中5-HT浓度在10～2000 ng/ml范围内，线性关系良好;定量下限为10 ng/ml，检测的精确度高。

2.3 基质效应得到三个血清浓度下的5-HT和一个浓度下的d4-5-HT的基质效应，具体基质效应数据分别详见表2。结果显示，本试验的血清样本处理方法及LC-MS/MS分离条件，生物样本的基质效应在可控范围内，得到的相对标准偏差RSD(又称变异系数)均小于6.7%，基质效应不影响5-HT血清浓度的测定。

2.4 精密度及准确度精密度通过测量值的相对标准差RSD来判定;准确度通过相对误差RE(%)=(测量值/真实值)×100%。根据QC样品结果计算本法的准确度与精密度，具体数据见表3。每一浓度水平的QC样品的日内RSD小于3.8%，日间RSD小于5.6%，RE在±4.9%之内。

表2 5-HT的基质效应 (%)

图1 二级全扫描质谱图 a:5-HT;b:内标d4-5-HT

图2 LC-MS/MS测定人血清中5-HT(Ⅰ)及内标d4-5-HT(Ⅱ)的典型色谱图 a:空白血样;b:空白血样+5-HT对照品;c:受试者血清样品

图3 5-HT血清标准曲线

2.5 稳定性高低两个浓度的样本在室温放置3 h、处理放置20 h、3次解冻循环以及冰箱储存的45天的长期放置等条件下的稳定性测定，具体测得的数据见表4。结果表明，5-HT血清样品室温放置3 h稳定(RE在±2.2%之间);经沉淀蛋白处理后室温放置20 h稳定(RE在±1.1%之间);经历3次冷冻－解冻循环稳定(RE在±0.3%之间);样品样品冷冻(－20℃)放置45天稳定(RE在±2.9%之间)。

2.6 提取回收率血清样品中5-HT的提取回收率数据祥见表5，提取回收率(%)均值大于85%，相对标准偏差RSD小于5.4%，具有较好的提取回收率。

表3 不同血清浓度5-HT的准确度和精密度

表4 5-HT的稳定性

表5 5-HT的提取回收率

3 讨论

评价一项新生物分析方法的优劣，主要通过考察它的方法特异性、定量下限、响应函数和校正范围(标准曲线性能)、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性以及提取回收率等特征［9～12］。本研究方法中的5-HT及d4-5-HT的出峰时间短，约为1.3 min，峰形良好且无内源性物质干扰，特异性好;定量下限达到10 ng/ml级别，检测的精确度高，标准曲线的线性关系良好。精密度是描述分析物重复测定的接近程度，也是验证重复性的好坏的一个指标，本研究中每一浓度水平的QC样品的日内RSD小于3.8%，日间RSD小于5.6%，数值远低于批内及批间变异系数不得超过15%的检测标准;准确度是描述该方法下的测量值与分析物标示浓度的接近程度，通过相对误差RE(%)来体现，准确度均值的相对误差一般应在质控样品标示值的±15%之内，显然本研究的RE在±4.9%之内，准确度高。本研究的基质效应的相对标准偏差RSD均小于7%，数值远低于基质效应变异系数不得大于15%的检测标准;高低两个浓度的样本在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的的稳定性好，相对误差RE小于±3%，完全符合RE应在±15%之内的标准。血清样品中5-HT的提取回收率(%)均值大于85%，相对标准偏差RSD小于5.4%，具有较好的提取回收率。因此，本研究的分析方法各项特征指标均达到或高于检测标准。

目前，检测5-HT的方法主要有生物法、放射免疫法、放射酶法、荧光光度法、高效液相色谱-紫外光检测法等［4，10］。早期的生物法现已不用;而放射免疫法虽有较好的灵敏度和特异性，但同位素标记对人体有害;荧光法虽使用较多，但操作麻烦，需要反复萃取，对检测物质有一定量的损失［13，14］;相比于这些检测方法，本研究开发的高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)虽有仪器昂贵和建立方法复杂的局限，但具有灵敏度高、特异性强、准确度和精密度高、重复性好、定量下限低、样本处理步骤简单、进样量少及检测时间短等优点。本实验根据《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》的规定，建立了5-HT的LC-MS/MS定量分析方法，结果也显示，LC-MS/MS的方法选择性好、基质效应很低、回收率高、稳定性好、定量下限低达10 ng/ml，完全能够满足生物样品分析的要求，并且出峰时间仅为1.3 min，结果准确可靠，具有高通量的优势，更适合于临床或科研中对5-HT的大批量样本检测。

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Determination of human serum 5-HT in by LC-MS/MS

HUANG Zhen，DONG Wei-guo (Department of Gastroenterology，People's Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China)

DONG Wei-guo

Objective To establish a rapid and sensitive method of liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LCMS/MS)for determination of 5-HT in human serum．MethodsUsing d4-5-HT as the internal standard(IS)，the sample was pretreated by simplified protein precipitated．Chromatography separation was performed on an Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6×50 mm，3.5 μm)column．APCI source was applied and operated in positive mode．The ion pair in quantitative analysis was m/z177.1/160.0(5-HT)，m/z181.1/164.0(d4-5-HT，IS)．ResultsFor 5-HT，calibration curve was linear in range from 10 to 2000 ng/ml(r=0.9996)．The limit of quantitation was 10 ng/ml．The recovery was more than 85%．The RSD of inter and intra day precisions were less than 15%，respectively．ConclusionThis method is found to be accurate，good reproducibility and sensitive for determination of 5-HT in human serum samples．

5-HT;Serum;LC-MS/MS

R446

A

1672-6170(2017)04-0041-05

2017-02-15;

2017-05-03)

董卫国