赵 阔 谢更祥 陈 艳 张红建 罗 山 张连中 郑联合

（海南省粮油科学研究所，海南 琼海 571400）

贝壳粉对储粮霉菌抑制作用的研究

赵 阔 谢更祥 陈 艳 张红建 罗 山 张连中 郑联合

（海南省粮油科学研究所，海南 琼海 571400）

本研究通过直接粉碎、煅烧、酸处理和碱处理四种工艺制备贝壳粉，研究了贝壳粉对灰绿曲霉、黄曲霉、青霉、根霉和高大毛霉五种储粮霉菌的抑制效果，并进行了模拟储藏试验。研究结果表明：四种工艺制备的贝壳粉均具有良好的抑菌作用，抑菌能力由高到低依次为：酸处理、碱处理、煅烧、直接粉碎。本研究为贝壳粉在储粮行业的应用奠定了基础。

贝壳粉；储粮霉菌；抑制

粮食始终是关系着我国国民经济发展的重要资源，是全面建设小康社会的重大战略性物质基础。粮食储藏是粮食保存的根本。对粮食储藏危害最严重的生物因素，主要是储粮害虫和储粮微生物。储粮害虫易察觉，微生物不易察觉，而微生物中霉菌对储粮的危害最严重[1]。当环境温湿度满足霉菌生长条件后，储粮就很容易发生霉腐现象[2]，有的还会代谢产生毒素，严重威胁到人畜的生命健康[3-4]。本研究利用贝壳的防腐、抑菌作用[5-7]，研究了不同工艺制备的贝壳粉，对储粮霉菌的抑制效果，以期为贝壳粉在粮食储藏中的应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

贝壳，购自海鲜市场；稻谷,农家收购；灰绿曲霉、黄曲霉、青霉、根霉、高大毛霉,来自上海复祥生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

玻璃干燥器，沈阳一化玻商贸有限公司；AY220电子天平，日本岛津；UPN-11-10T超纯水制造系统，四川优普超纯科技有限公司；XSP-BM-2CA生物显微镜，上海彼爱姆光学仪器厂；SX2-4-10马弗炉,上海跃进医疗器械厂；LRH-150-S恒温恒湿培养箱，广东医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 贝壳预处理。将贝壳用清水清洗干净，除去黏附杂质，晾干备用。

1.3.2 贝壳粉制备[8-12]。（1）直接粉碎：将贝壳直接粉碎，过60目筛。（2）煅烧处理：将直接粉碎后的贝壳粉放入高温煅烧炉中煅烧1h，取出自然冷却。（3）酸处理：用稀盐酸溶液浸泡直接粉碎的贝壳粉，10min后取出，用去离子水洗涤3～4次，晾干，过60目筛。（4）碱处理：用NaOH溶液浸泡直接粉碎的贝壳粉，30min后取出，用去离子水洗涤3～4次，晾干，过60目筛。

1.3.3 制备培养基[13]。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：将马铃薯洗净去皮，取200g切成小块，加水1000mL，煮沸半小时后，补足水分。在滤液中加入10g琼脂，煮沸溶解后加葡萄糖20g，补足水分，分装，灭菌，备用。

1.3.4 预试验。先取将贝壳粉添加到PDA培养基中，制成贝壳粉-PDA培养基，然后将灰绿曲霉、黄曲霉、青霉、根霉和高大毛霉5种霉菌活化后，分别制备成菌悬液，接种到贝壳粉-PDA培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养，5天后观察菌落总数。确定贝壳粉最佳用量、煅烧处理最佳煅烧温度、酸处理最佳酸液浓度和碱处理最佳碱液浓度。

1.3.5 模拟储藏试验[14]。用玻璃干燥器作为模拟仓，如图1所示。海南常年高温高湿，储藏条件恶劣时仓温甚至高达35℃，湿度达80%以上[15]。根据2010年版中国药典，35℃下饱和氯化钾溶液相对应的湿度为84%。将适量饱和氯化钾溶液倒入干燥器底部，模拟仓内湿度。在干燥器隔板上放置过滤筛网，将直接粉碎、煅烧、酸处理、碱处理的贝壳粉分别以0.5%的剂量与稻谷混合均匀，置于筛网上，装入体积约为干燥器的50%。将干燥器盖子盖上，置于35℃恒温培养箱中储藏。以不添加贝壳粉为对照。每隔5天取样，进行霉菌孢子计数。称取10.0g稻谷于50mL试管中，加入30mL去离子水，加塞用力上下振荡1min，用200目筛网过滤，取滤液于显微镜下进行霉菌孢子计数。

2 结果与分析

2.1 贝壳粉最佳用量的确定

取直接粉碎的贝壳粉0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g，分别添加到200mLPDA培养基中，以不添加贝壳粉的培养基为对照，将灰绿曲霉等5种霉菌的菌悬液，接种到贝壳粉-PDA培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养，5天后观察菌落总数，确定贝壳粉最佳用量。

试验结果如图2所示。由图2可以看出，添加了贝壳粉的培养基上菌落总数，明显低于对照，说明贝壳粉对5种霉菌生长均有抑制作用，这与文献报道中关于贝壳有抑菌作用的说法一致；随着贝壳粉用量增加，培养基上菌落总数减少，抑菌效果增强，但贝壳粉用量增加到1.0g以后，增加用量抑菌效果变化不明显，估计此时贝壳粉的抑制作用达到相对饱和状态，因此确定贝壳粉最佳用量为1.0g。

图1 贝壳粉用量对菌落总数的影响

2.2 煅烧温度的确定

直接粉碎的贝壳粉分别至于200℃、400℃、600℃、800℃、1000℃高温炉中煅烧1h，冷却后各取1.0g，分别添加到200mL PDA培养基中，以添加等量直接粉碎的贝壳粉为照，将灰绿曲霉等5种霉菌的菌悬液，接种到贝壳粉-PDA培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养，5天后观察菌落总数，确定贝壳粉最佳煅烧温度。

试验结果如图2所示。由图2可以看出，煅烧温度对贝壳粉的抑菌能力有一定影响，经过不同温度煅烧后的贝壳粉的抑菌能力，均比不经过煅烧的贝壳粉（对照）的抑菌能力强。煅烧温度低于600℃时，煅烧温度越高贝壳粉的抑菌能力越强，可能是因为煅烧过程中贝壳粉中的有机物发生了氧化、分解，产生了对霉菌有抑制作用的物质。但煅烧温度高于600℃后，贝壳粉的抑菌能力变化不明显，说明此时贝壳粉中的有机物全部分解完毕，贝壳粉中的碳酸钙开始分解为氧化钙。因此，确定最佳煅烧温度为600℃。

图2 煅烧温度对贝壳粉抑菌作用的影响

2.3 酸处理浓度的确定

用0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%盐酸溶液，分别浸泡处理直接粉碎的贝壳粉，10min后取出，水洗3～4次，晾干后过60目筛。然后取酸处理贝壳粉各1.0g，分别添加到200mL PDA培养基中，以添加等量直接粉碎的贝壳粉为对照，将灰绿曲霉等5种霉菌的菌悬液接种到贝壳粉-PDA培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养，5天后观察菌落总数。

图3 盐酸溶液浓度对贝壳粉抑菌作用的影响

试验结果如图3所示。由图3可以看出，盐酸溶液浓度对贝壳粉的抑菌效果有较大影响，添加了酸处理贝壳粉的培养基上菌落总数明显低于对照。分析其原因，可能是因为盐酸处理过程中，盐酸与贝壳中的碳酸钙发生化学反应，增加了贝壳粉的表面积，并且盐酸溶液渗透进贝壳粉的微孔中，清除了微孔中的杂质，使微孔扩大，表面积进一步增加，提高了抑菌能力。但盐酸浓度增加到0.6%以后，再增加盐酸溶液浓度，贝壳粉的抑菌能力逐渐减弱，说明盐酸溶液浓度过高反应过于激烈，会破坏贝壳粉中的有效抑菌成分，降低贝壳粉的抑菌能力。因此，确定盐酸溶液浓度为0.6%。

2.4 碱处理浓度的确定

用1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%的氢氧化钠溶液，分别浸泡处理贝壳粉，30min后取出，水洗3～4次，晾干后过60目筛。然后取碱处理贝壳粉各1.0g，分别添加到200mL PDA培养基中，以添加等量直接粉碎的贝壳粉的培养基作对照，将灰绿曲霉等5种霉菌的菌悬液接种到培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养，5天后观察菌落总数。

试验结果如图4所示。由图4可以看出，碱处理对贝壳粉的抑菌能力也有一定的影响，分析其原因，可能是碱处理过程中氢氧化钠与贝壳粉中的氨基酸等化学成分发生反应，生成了具有抑菌作用的胺、氨基酸盐或衍生物[16]，提高了贝壳粉的抑菌能力。但氢氧化钠溶液浓度＞1.2%时，抑菌效果减弱，说明高浓度的氢氧化钾会减少贝壳粉中的抑菌成分。因此，确定氢氧化钾溶液浓度为1.2%。

图4 氢氧化钠溶液浓度对贝壳粉抑菌作用的影响

2.5 不同工艺处理效果对比分析

试验结果如表1所示。在高温高湿条件下（35 ℃、RH 84%），对照组稻谷表面的霉菌孢子呈动态上升趋势，符合典型的储粮真菌生长特征。经过贝壳粉处理过的稻谷表面霉菌受到不同程度的抑制，其中酸处理的贝壳粉的抑菌效果最佳，因此酸处理贝壳粉在粮食储藏中有很好的应用价值。

表1 稻谷模拟储藏后表面霉菌孢子数单位：（个/g）

3 结论

直接粉碎、煅烧、酸处理、碱处理的贝壳粉，均对霉菌具有良好的抑制作用。在200mL PDA培养基中，直接粉碎的贝壳粉的饱和用量为1.0g；煅烧处理贝壳粉工艺的最佳煅烧温度为600℃；酸处理工艺最佳盐酸浓度为0.6%；碱处理工艺最佳氢氧化钠浓度为1.2%。四种工艺的抑菌能力由高到低依次为：酸处理、碱处理、煅烧、直接粉碎。本研究为贝壳粉在粮食储藏中的应用奠定了基础。

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