常丽娟，宋 君，刘文娟，张富丽，王 东，尹 全，雷绍荣

(四川省农业科学院分析测试中心，四川 成都 610066)



转Bt基因抗虫棉外源Bt蛋白的差异表达

常丽娟，宋 君，刘文娟，张富丽，王 东，尹 全，雷绍荣

(四川省农业科学院分析测试中心，四川 成都 610066)

【目的】研究转Bt基因抗虫棉外源Bt蛋白表达的时空规律，明确Bt蛋白表达量和转Bt基因抗虫棉抗性的内在联系，更加有效降低靶标害虫危害。【方法】采用ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)蛋白定量检测方法，以转Bt基因抗虫棉鄂抗虫棉1号(GK19)为研究材料，对转Bt基因抗虫棉不同组织器官、不同生长时期主茎功能叶和不同生长时期主茎不同叶位叶片的Bt蛋白含量进行检测。【结果】转Bt基因抗虫棉不同组织器官Bt蛋白含量存在差异，苗期叶片最高，花、蕾、铃次之，根、茎较低；不同生长时期主茎功能叶Bt蛋白含量呈现出随生长发育时间推进而降低的趋势；不同生长时期主茎不同叶位叶片Bt蛋白含量差异较大，苗期和盛蕾期第1～7叶呈现出逐渐下降的趋势，而盛花期和盛铃期第1～7叶呈现出先缓慢升高后逐渐稳定的趋势。【结论】Bt蛋白在转Bt基因抗虫棉各生长时期，各组织器官都有表达，且表达量呈时空动态变化。

转Bt基因抗虫棉；ELISA；Bt蛋白含量；差异表达

【研究意义】棉花是我国广泛种植的经济作物。长期以来，由于棉铃虫的危害使棉花产量显著下降，给我国经济造成了严重损失。棉铃虫田间防治通常采用喷洒化学农药的方法，随着农药使用时间的延长，棉铃虫的抗药性逐年增加，且农药在环境中大量累积，危害人类身体健康。转基因抗虫棉的培育成功解决了棉铃虫传统防治所面临的问题，国内大多转基因抗虫棉品种都转入了来自苏云金芽孢杆菌的Bt基因，由该基因编码的Bt蛋白对鳞翅目、鞘翅目昆虫具有特异毒性。Bt蛋白表达量直接决定转基因抗虫棉的抗性。【前人研究进展】已有研究发现，Bt蛋白表达具有时空效应[1-3]且易受环境因素影响，如温度[4-5]、湿度[5]、干旱和渍涝[6]、盐胁迫[7]、氮肥施用量[8]等都可影响Bt蛋白表达量。【拟解决的关键问题】在四川生态环境条件下种植长江流域具有代表性的抗虫棉品种鄂抗虫棉1号，并对鄂抗虫棉1号不同组织器官、不同生长时期主茎功能叶和不同生长时期主茎不同叶位叶片的Bt蛋白含量进行研究，旨在探究Bt蛋白表达的时空变化规律，为长江流域转Bt基因抗虫棉的田间种植提供理论依据。

表1 不同组织器官Bt蛋白含量

注：同列数据后标不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note： Data in the same row followed by different lowercase letters shows significant difference at 0.05 level.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的转Bt基因抗虫棉品种为鄂抗虫棉1号。田间种植4月播种，行距0.4 m，株距0.3 m，采用随机区组设计，每个品种种植3个小区，每个小区种植100株，常规管理。

1.2 试验方法

1.2.1 取样 每个小区随机抽取20株转基因抗虫棉，取苗期根、茎和叶片；花期花和叶片；蕾期蕾和叶片；铃期铃和叶片。叶片采集植株主茎顶部倒数第1～7片完全展开的叶片，蕾采集直径约5 mm的小蕾，铃采集直径约1 cm的小铃。

1.2.2 待测样品的处理 将采集的转Bt基因抗虫棉样品液氮研磨，每个样品研磨后迅速称取0.4 g粉末于离心管中，向离心管中加入4 mL的PBS溶液(由Envirologix试剂盒提供的提取缓冲液粉末溶解后再加5 %的吐温配置而成)，低温摇床振荡12 h，取出样品放于低温高速离心机4 ℃、8000 r/min离心20 min，取上清液备用。

1.2.3 可溶性总蛋白含量的检测 按照BCA 蛋白含量检测试剂盒要求稀释标准曲线，并稀释待测样品的可溶性总蛋白浓度至标准曲线范围内，将25 μl BSA标准液和待测样品分别加入到酶标板内相应位置，然后加入BCA 工作液200 μl，充分混匀37 ℃放置30 min后，在562 nm波长下读取光密度值，建立标准曲线并计算样品中可溶性总蛋白的含量。

1.2.4 Bt蛋白含量的检测 Bt 蛋白含量采用Envirologix试剂盒测定，按照试剂盒说明书，将标准蛋白稀释成1.00、0.80、0.64、0.46、0.28、0.10 ng·mL-16个浓度梯度，并稀释待测样品的Bt 蛋白浓度至标准曲线范围内，将标准液和待测样品一起加入酶标板内相应位置，得到相应的光密度值，建立标准曲线并计算样品中单位鲜重Bt 蛋白的含量。

1.3 数据处理

采用 Excel 2007和SPSS 13.0 软件进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同组织器官Bt蛋白含量的检测

分别对转Bt基因抗虫棉苗期根、茎和叶片、蕾期蕾、花期花、铃期铃的 Bt 蛋白含量进行检测，实验结果发现，苗期叶片可溶性总蛋白含量最高，根可溶性总蛋白含量最低，不同组织器官间可溶性总蛋白含量无显著差异。单位可溶性总蛋白Bt蛋白含量苗期叶片最高，与其他组织器官差异显著；花、蕾、铃Bt 蛋白含量次之；根、茎Bt 蛋白含量较低，与叶、花、蕾、铃差异显著(表1)。

2.2 不同生长时期主茎功能叶Bt蛋白含量的检测

为了研究转Bt基因抗虫棉不同生长时期主茎功能叶Bt蛋白含量是否存在差异(图1)，分别采集苗期、盛蕾期、盛花期和盛铃期主茎顶端倒数第3片完全展开的叶片为样本，对样品单位鲜重Bt蛋白含量和可溶性总蛋白含量进行了检测。数据分析发现，单位可溶性总蛋白Bt蛋白含量苗期叶片最高；盛蕾期叶片缓慢降低；盛花期叶片下降幅度较大，与苗期叶片和盛蕾期叶片均差异显著；盛铃期叶片最低，不同生长时期主茎功能叶单位可溶性总蛋白Bt蛋白含量呈现出随生长发育时间推进而降低的趋势。

2.3 不同生长时期主茎不同叶位叶片Bt蛋白含量的检测

对转Bt基因抗虫棉不同生长时期主茎不同叶位叶片Bt蛋白含量进行检测，实验结果发现，苗期和盛蕾期顶部倒数第1～7叶单位可溶性总蛋白Bt蛋白含量呈现出逐渐下降的趋势，前3叶下降幅度较大，第4叶后Bt蛋白含量缓慢下降；而盛花期和盛铃期顶部倒数第1～7叶Bt蛋白含量呈现出先缓慢升高后逐渐稳定的趋势(图2，表2)。

表2 不同时期主茎不同叶位叶片Bt蛋白含量

注：同列数据后标不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note： Data in the same row followed by different lowercase letters shows significant difference at 0.05 level.

3 讨 论

迄今为止，我国农业部批准种植的转Bt基因抗虫棉外源基因有cryIAb和cryIAc2个基因，外源基因启动子大多采用花椰菜花叶病毒35 S启动子(CaMV35S)。已有研究表明，由CaMV35S启动的外源基因在不同类型的植物中表达量不尽相同[9]，在同种植物的不同发育阶段、不同的组织器官表达量也存在差异[10-11]。陈松等[1]报道，在苗期全展功能叶中Bt蛋白含量最高，根、茎和叶柄中Bt蛋白含量较低；不同生育期叶片Bt蛋白含量苗期叶片最高，蕾期次之，花铃期最低。本试验研究发现，Bt蛋白含量在苗期叶片中最高，蕾、花、铃次之，根、茎较低；不同生长时期功能叶Bt蛋白含量呈现出随生长发育时间推进而降低的趋势，与陈松的研究结果相一致。孙伟等[2]研究发现，苗期主茎不同叶位叶片Bt蛋白含量呈现出先升高后降低的趋势。本试验对鄂抗虫棉1号不同生长时期不同叶位叶片Bt蛋白含量研究发现；苗期和盛蕾期第1～7叶Bt蛋白含量呈现出逐渐下降的趋势，而盛花期和盛铃期第1～7叶Bt蛋白含量呈现出先缓慢升高后逐渐稳定的趋势，苗期实验结果与已有研究结果不符，可能是由于实验选用的转基因抗虫棉品种不同、采用的Bt蛋白检测方法不同或种植地生态环境不同等多方面因素影响的结果。由实验结果可以看出，抗虫棉生长发育后期Bt蛋白含量下降较快，而这个时间正好是田间第四代棉铃虫的高发时期，提高Bt蛋白在抗虫棉生长发育后期的表达量是亟待解决的问题。

图1 不同时期主茎功能叶Bt蛋白含量Fig.1 Contents of Bt protein in main stem functional leaves of different growth stages

图2 不同时期主茎不同叶位叶片Bt蛋白含量Fig.2 Contents of Bt protein in main stem leaves of different positions in different growth stages

[1]陈 松，吴敬音，周宝良，等. 转Bt基因棉Bt毒蛋白表达量的时空变化[J]. 棉花学报，2000，12(4)：189-193.

[2]孙 伟，曹玉洪. 转Bt基因抗虫棉Bt毒蛋白表达量的时空变化[J]. 安徽农业科学，2005，33(2)：202-203.

[3]李汝忠，沈法富，王宗文，等. 转Bt基因抗虫棉Bt基因表达的时空动态[J]. 山东农业科学，2002(2)：7-9.

[4]姜周庚，张延昭，冯梦诗，等. 高温胁迫对盛铃期Bt棉棉铃中杀虫蛋白表达量及氮代谢的影响[J]. 中国棉花，2012，39(4)：13-32.

[5]张 祥，王桂霞，顾 超，等. 高温和湿度对转Bt基因棉叶片 Bt 蛋白表达的影响[J]. 应用生态学报，2012，23(11)：3016-3020.

[6]王家宝，王留明，沈法富，等. 环境因素对转Bt基因棉Bt杀虫蛋白表达量的影响[J]. 山东农业科学，2000(6)：4-6.

[7]张桂玲，温四民. 盐胁迫对转Bt基因棉苗期Bt蛋白表达量和氮代谢的影响[J]. 西北农业学报，2011，20(6)：106-109.

[8]代建龙，董合忠，段留生，等. 施氮肥对盐胁迫下Bt棉生长和叶片Bt蛋白含量的影响[J]. 棉花学报，2012，24(4)：303-311.

[9]Narvaez-Vasquez J, Orozca-Cardenas M L, Ryan C A. Differential expression of a chimeric CaMV-tomato proteinase Inhibitor I gene in leaves of transformed nightshade, tobacco and alfalfa plants[J]. Plant Molecular Biology, 1992, 20: 1149-1157.

[10]Mazier M, Chaufaux J, Sanchis V, et al. The cryic gene fromBacillusthuringiensisprovides protection againstSpodopteralittoralisin young transgenic plants[J]. Plant Science, 1997, 127: 179-190.

[11]Pauk J, Stefanov I, Fekete S, et al. A study of different (CaMV 35S and mas) promoter activities and risk assessment of field use in transgenic rapeseed plants[J]. Euphytica, 1995, 85: 411-416.

(责任编辑 陈 虹)

Study on Bt Protein Differential Expression inBtTransgenic Cotton

CHANG Li-juan, SONG Jun, LIU Wen-juan, ZHANG Fu-li, WANG Dong, YIN Quan, LEI Shao-rong

(Analysis and Test Center, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066 China)

【Objective】Studying on the temporal and spatial dynamics of Bt protein expression in Bt transgenic cotton and determining the relation of Bt protein expression andBttransgenic cotton can effectively reduce the harm of target pests.【Method】In this paper, the Bt protein contents in the different tissues, organs, main stem functional leaves and main stem leaves at different positions of transgenic cotton cultivar(GKl9) in different growth stages were studied. 【Result】The Bt protein contents of all tissues and organs were different, which were in order of seedling>flower>boll> bud>root>stem. There was a reduction tendency of Bt protein in main stem functional leaves in different growth stages with the advance of development. The Bt protein contents among main stem leaves at different positions in different growth stages were obviously different, which indicated the gradual decrease from the first to the seventh leaves in seedling and full budding stage and a gradual stabilization after a slow increase from the first to the seventh leaves in full flowering and bolling stages. 【Conclusion】The Bt protein in all growth periods, all tissues and organs ofBttransgenic cotton were expressed, which changed with temporal and spatial dynamics.

TransgenicBtcotton; ELISA; Content of Bt protein; Differential expression

1001-4829(2017)6-1275-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.006

2016-01-20

四川省财政基因工程项目论文基金(2014LWJJ-011)

常丽娟(1982-)，女，硕士研究生，助理研究员，Email: juanjuanclj@126.com。

S435.622+.9

A