杨学芬 陆晓珊

云南省迪庆州食品药品检验所，云南 香格里拉 674499



HPLC法测定三九胃泰颗粒中氯化两面针碱的含量

杨学芬 陆晓珊

云南省迪庆州食品药品检验所，云南 香格里拉 674499

目的：建立高效液相色谱法测定三九胃泰颗粒中氯化两面针的含量的方法。方法：采用 Agilent 5 TC-C18(4.6mm×250.0mm)色谱柱为分析柱；采用流动相A:乙睛；B:0.2%的甲酸-三乙胺溶液(25∶75)，进行洗脱；流速为1 mL/min；检测波长为271nm；柱温25 ℃；采用70%甲醇超声提取。结果：氯化两面针碱回归方程：Y=1316.9176X-0.5712，r=0.9999，在 0.0600～0.5997μg·mL-1范围内线性关系良好，平均回收率为99.88%，RSD=0.50%。结论：该方法简单准确、重复性好，可用于三九胃泰颗粒中氯化两面针碱的含量测定。

高效液相色谱法；三九胃泰颗粒；氯化两面针碱

三九胃泰颗粒其主要由三叉苦、九里香、黄芩、两面针、木香、茯苓、白芍、地黄等药物[1]组成，具有清热燥湿、行气活血、柔肝止痛的功效。临床主要用于湿热内蕴、气滞血瘀所致的胃痛，症见脘腹隐痛、饱胀反酸、恶心呕吐、嘈杂纳减；浅表性胃炎、糜烂性胃炎、萎缩性胃炎等见上述症候者[2]。两面针为三九胃泰制剂的主要原料，其性平，味苦、辛，有小毒，归肝、胃经，具有活血化瘀、行气止痛、祛风通络、解毒消肿等功能，用于跌打损伤，胃痛，牙痛，风湿痹痛，蛇毒咬伤[3-4]；外治烧烫伤。药理研究证实[3]，两面针药理作用广泛，具有镇痛、抗炎、镇静、抗氧化、抗癌、抗菌、抗胃溃疡、对心肌缺血再灌注的保护等作用。而氯化两面针碱是两面针的主要有效成分之一[5-6]，其具有很好的抗肿瘤活性，在体外能显著抑制鼻咽癌、口腔鳞癌、肺癌等细胞的增殖[5]，通常作为两面针的质量控制指标。2015年版《中华人民共和国药典》一部对三九胃泰颗粒中两面针采用的是薄层色谱法对其进行定性鉴别[2]。笔者采用高效液相色谱法测定三九胃泰颗粒中氯化两面针碱的含量，以此控制该制剂中氯化两面针碱的含量，并对该方法进行了验证。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；UV-2250紫外-可见分光光度计(日本岛津)；T-214 电子天平(美国，赛多利斯)；SB-5200 DTD 超声波清洗机(赛飞中国，Biosafer)；GM-0.33A隔膜真空泵(天津津腾)。

1.2 试药 氯化两面针碱对照品(批号：B20783-20，上海源叶生物科技有限公司)；甲醇、乙腈、磷酸、三乙胺均为色谱纯(美国TEDIA)，水为娃哈哈纯化水。三九胃泰颗粒某医药公司生产。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent 5 TC-C18(250mm×4.6mm)； 以乙腈为流动相A，以0.2%甲酸-三乙胺为流动相B(25∶75)进行洗脱，检测波长271nm；流速1mL/min；柱温25℃；进样量10μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取氯化两面针碱对照品15.30mg，置50mL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液(含氯化两面针碱299.88μg·mL-1)，精密量取对照品储备溶液3mL，置50mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1mL含氯化两面针碱17.99μg)。

2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下内容物混匀、研细，精密称取0.3g，置50mL量瓶中，加70%甲醇适量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备 取处方中除两面针药材外的原辅料，按处方剂量、制法和工艺要求制备缺两面针药材的空白样品，按照2.3供试品溶液的制备方法进行处理即得阴性样品溶液。

2.5 专属性试验 按上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10μL，注入液相色谱仪测定，结果供试品色谱图中呈现与对照品保留时间一致的色谱峰，阴性样品在与氯化两面针碱对照品相同的保留时间处未显色谱峰。可见其他原辅料对氯化两面针碱峰无干扰。对照品、样品与阴性样品色谱图见图1～3。

2.6 线性关系考察 分别精密吸取对照品储备溶液1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL置50mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为6.00、12.00、17.99、23.99、35.99、47.98、59.97μg·mL-1的溶液，作为对照品系列溶液。按上述色谱条件，分别吸取10μL注入液相色谱仪中进行测定，以对照品进样量μg为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线进行线性回归，其回归方程为：Y=1316.9176X-0.5712,r=0.9999。结果表明对照品进样量在 0.0600～0.5997μg·mL-1范围内呈现线性关系良好。结果见表1。

表1 线性关系考察

2.7 稳定性试验 取同一供试品(批号1601039F)溶液6份，按上述色谱条件，分别于室温放置0、2、4、6、8、12h后测定其峰面积分别为225.55、224.60、221.08、222.52、226.65、223.48，平均峰面积为223.98，在0～12h氯化两面针碱的峰面积的RSD为0.91% 表明供试品溶液于室温放置12h内稳定性较好。

2.8 重复性试验 取同一批号的样品(批号：1603056F)，按含量测定方法，分别制备6份供试品溶液，测得氯化两面针碱平均含量为2.92mg/g，RSD=0.77%，结果表明此方法重复性良好。结果见表2。

表2 氯化两面针碱重复性试验结果

2.9 精密度试验 精密吸取浓度为17.99μg/mL的氯化两面针碱对照品溶液10μL，按上述色谱条件，连续测定5次，测得氯化两面针碱峰面积积分值分别为235.44、235.51、234.92、235.09、235.10，平均峰面积235.21，RSD=0.11%，说明仪器精密度良好。

2.10 回收率试验 精密称取6份供试品(批号：1603056F，已测氯化两面针碱含量为2.92mg/g)，每份约0.15g，按1∶1比例加入对照品储备溶液(含氯化两面针碱299.88μg/mL)1.5mL，挥去溶剂。然后按供试品溶液处理方法同法处理，将处理好的供试品溶液按含量测定方法同法测定，计算平均回收率为99.88%，RSD为0.50%。表明回收率较好，该方法准确度较高。结果见表3。

表3 回收率试验结果 (n=6)

2.11 样品含量测定 取3个批号的三九胃泰颗粒样品(每批精密称定0.3g，各两份)，依法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，按外标法分别计算含量，3批样品中氯化两面针碱的平均含量为3.01mg/g。结果见表4。

表4 样品含量结果

3 讨论

3.1 供试品溶液的提取方法的选择 实验设计采用70%甲醇超声法[2]、80%乙醇回流法[7]、索式提取法[10]三种方法对三九胃泰颗粒中氯化两面针碱进行提取，通过回收率实验确定采用70%甲醇超声法回收率最高。

3.2 流动相的选择 实验中采用了三种流动相对氯化两面针碱对照品溶液进行高效液相色谱法检测，采用0.2%的磷酸二氢钾溶液-乙腈(55∶45)加磷酸调pH值至3.0作为流动相[7]，其峰保留时间较短，会受样品杂质峰影响；采用乙腈-水-磷酸-三乙胺(75∶25∶1∶1)作为流动相[8-9]，其峰形较差，保留时间长；采用流动相A:乙睛；B:0.2%的甲酸-三乙胺溶液，进行洗脱(25∶75)[2]，能够有效进行分离，峰形较好。

3.3 柱温的选择 在实验中采用25℃、30℃、40℃的柱温及室温下进行检测，发现不同的柱温对试验无明显影响，故本实验采用25℃柱温进行实验。

综上，该方法具有良好的精密度和准确性，回收率较好，同时操作简便，重复性好，可以对三九胃泰颗粒进行更好的质量控制。

[1]张震.三九胃泰颗粒治疗功能性消化不良的临床观察[D].武汉:湖北中医药大学,2014.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2015.

[3]谈英.三九胃泰主要原料“两面针”资源的合理开发利用研究[D].广州:广州中医药大学,2011.

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[5]刘丽敏.氯化两面针碱抗肿瘤效应及其分子机制初步研究[D].南宁:广西医科大学，2009.

[6]刘丽敏,刘华钢.氯化两面针碱的研究近况[J].时珍国医国药,2007,18(1):60-62.

[7]赵森.两面针镇痛缓释片的研究[D].沈阳:辽宁中医药大学,2009.

[8]方琳乔,卢凌春,龙盛京.HPLC法同时测定两面针中氯化两面针碱与乙氧基白屈菜碱的含量[J].西北药学杂志,2011,26(1):18-20.

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Using HPLC Method to Determine the Content of the Two Side of Choride in the Tri-ninth Gastric Granules

YANG Xuefen LU Xiaoshan

The Food and Drug Tests of Diqing Tibetan Autonomous Prefecture,Shangrila 674499,China

Objective To establish the method of HPLC determination for nitidine chloride in Sanjiuweitai granules.Methods Chromatograhy separation was carried out on an Eclipse plus C18(4.6mm×250.0mm),using mobile phase A:acetonitrile; B:0.2% formic acid-captured the (25∶75), triethylamine solution for elution; online.And an UV detection wavelength of 271nm at a flow rate of 1.0mL·min-1at maintaining column temperature at 25℃.The extracted with 70% ethanol reflux method.Results The calibration of nitidine chloride was linear between 0.0600～0.5997μg·mL-1,the linear regression equation wasY=1316.9176X-0.5712,r=0.9999.The average recovery rate was 99.88% andRSDwas0.50%.Conclusion It is simple and accurate with a reproducibility to used the method of High performance liquid chromatography determination for nitidine chloride in Sanjiuweitai granules.

High Performance Liquid Chromatography (HPLC); Sanjiuweitai Granules; Nitidine Chloride

杨学芬(1971-)，女，纳西族，本科，主管药师，研究方向为药学。E-mail:895803766@qq.com

R284

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1007-8517(2017)13-0025-03

2017-04-27 编辑：穆丽华)