胡佳瑶, 张梅妍, 王振灵, 魏 娜, 高炳淼

海南医学院, 海南省热带药用植物研究开发重点实验室, 海口 571199



海马总蛋白提取及其酶解条件优化

胡佳瑶, 张梅妍, 王振灵, 魏 娜, 高炳淼*

海南医学院, 海南省热带药用植物研究开发重点实验室, 海口 571199

为了提取海马总蛋白并确定最佳的酶解条件，将海马粉碎后采用水提法提取海马总蛋白。分别选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，在不同酶解pH、时间、温度和E/S条件下进行单因素和正交试验法对海马总蛋白的酶解条件进行优化。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和BCA法来分别检测不同条件下的酶解情况及其蛋白含量，根据蛋白水解度来确定其最佳的酶解条件。实验结果表明：从10 g干海马中提取总蛋白为1.056 g，蛋白浓度为0.106 g/mL。海马总蛋白的最佳水解酶为碱性蛋白酶，其最佳酶解条件为：pH 9,E/S为5%,温度为50℃,时间为3 h，获得海马总蛋白的最大水解度为96.9%。研究获得了海马总蛋白及其最佳酶解条件，并为海马多肽生物活性研究奠定了基础。

海马；蛋白；酶解条件；优化

海马(Hippocampus)隶属于鱼纲海龙目海龙科，是一种海洋硬骨鱼类动物，作为一种药食同源的珍贵物种，素有“南方人参”的美誉[1,2]。现代药理研究表明，海马具有抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老、抗血栓、镇痛和激素样作用[3,4]。海马所含化学成分主要有甾体类合成物、脂肪酸、蛋白质、氨基酸和微量元素等[5～7]。近年来科研工作者主要专注于研究海马的化学成分，而忽略了对其水溶性组分中蛋白质、多糖、多肽和核酸的研究[8]。其中生物活性多肽具有免疫调节、激素调节、酶调节、抗病毒、抗氧化、抗疲劳、降血压和降血脂等功能，且可作为药物或药物的前体，使用安全，人体吸收速率比氨基酸高，所以日益受到人们的重视[9]。

本实验采用水提法提取海马中的总蛋白，研究不同蛋白酶、pH、酶与底物质量比(E/S)、酶解温度和酶解时间对海马蛋白酶解的影响。采用水解度为指标，通过单因素和正交试验确定最佳酶解条件，以期为海马多肽的生物活性研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

干海马购买于海口市养年堂大药房，经鉴定为小海马；中性蛋白酶(上海一研生物科技有限公司)；木瓜蛋白酶(上海广锐生物科技有限公司)；胰蛋白酶(湖北远成药业有限公司)；碱性蛋白酶(太原发凯化工有限公司)；蛋白Marker(上海伟进生物科技有限公司)；BCA法蛋白含量测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

真空旋转蒸发仪(上海科升仪器有限公司)；高速粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂)；台式低速大容量离心机(济南博鑫生物技术有限公司)；紫外可见分光光度计(上海鼎科科学仪器有限公司)；数字型pH计(杭州科晓化工仪器设备有限公司)；恒温水浴锅(上海启前电子科技有限公司)。

1.3 海马总蛋白的提取

称取干燥海马10 g剪碎，用高速粉碎机粉碎，用去离子水100 mL提取，在4℃下浸泡24 h，将浸泡好的小海马进行离心，4 000 r/min离心5 min，将离心好的上清液保存下来，得到粗品，将粗品保存至-80℃冰箱，进行真空冷冻干燥，冻成干粉，保存至-20℃冰箱冻干备用。

1.4 总蛋白和多肽的测定

总蛋白和水解后多肽均采用BCA蛋白浓度测定试剂盒法来测定，具体实验步骤按说明书进行操作。

1.5 海马总蛋白及其多肽的SDS-PAGE分析

按配方配制胶，取出10 μL冻干水提液与10 μL 2×Loading Buffer缓冲液混匀，取Marker 10 μL，置水浴锅中95℃煮沸5 min，1 000 r/min离心2 min后取上清上样，电泳90 min后，经染色液在摇床上染色6 h，进行脱色观察，用凝胶成像系统扫描照相记录电泳结果。

1.6 酶解条件优化

称取海马总蛋白若干份，选取不同的蛋白酶、pH、温度、时间、E/S(酶用量)对其进行酶解处理。然后对其抽提、浓缩、称重，以水解度为参考指标，以确定pH、温度以及酶解时间对水解度的影响。酶解产物经30 kDa超滤管离心，收集滤液(小于30 kDa酶解多肽)，经BCA法测定多肽含量。水解度(%)=(多肽含量/总蛋白量)×100%。通过单因素和正交试验分析，以确定最佳的酶解条件。

1.6.1 酶的种类对海马蛋白水解度的影响 选择木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶在各自理论最适条件下酶解海马总蛋白，经SDS-PAGE电泳分别分析以上4种酶对海马蛋白水解度的影响；并以表1中具体酶解条件为标准，用BCA法测定各个酶解产物的水解度从而选出酶解总蛋白的最佳蛋白酶。

表1 4种蛋白酶活性的最适条件

1.6.2 酶解pH对海马蛋白水解度的影响 取200 μL海马蛋白浓缩液，分别在 pH 7、8、9、10、11条件下，55℃酶解3 h；以pH为横坐标，水解度为纵坐标作图。

1.6.3 酶解温度对海马蛋白水解度的影响 取200 μL海马蛋白浓缩液，分别在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃条件下，pH为9时酶解3 h；以酶解温度为横坐标，水解度为纵坐标作图。

1.6.4 酶解时间对海马蛋白水解度的影响 取200 μL海马蛋白浓缩液，在 pH为9，55℃条件下分别酶解1 h、3 h、5 h、7 h、9 h；以酶解时间为横坐标，水解度为纵坐标作图。

1.6.5 酶解E/S对海马蛋白水解度的影响 取200 μL海马蛋白浓缩液，分别控制酶解pH为9，酶解时间为3 h，酶解温度为55℃，分别控制E/S 为 1%、2%、3%、4%、5%；以E/S为横坐标，水解度为纵坐标作图。

1.6.6 正交试验 在上述单因素实验的基础上，综合考虑各因素，使用正交实验用于研究海马总蛋白与碱性蛋白酶的最佳水解条件。pH、温度、时间、E/S被选为独立变量，采用4因素3水平L9(34)进行正交试验(表2)，水解度是因变量。

表2 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 海马总蛋白提取及含量测定

通过水提法获得的海马总蛋白如图1所示，经BCA蛋白定量法测定结果表明，从10 g干海马中提取到的总蛋白为1.056 g，蛋白浓度为0.106 g/mL。从图1可以看出，10 μL样品溶液通过SDS-PAGE电泳显示较明显，海马总蛋白的分子量主要分布在约97.4 kDa，部分位于31 kDa左右，14.4 kDa以下部分蛋白较少。

图1 海马总蛋白的电泳分析Fig.1 Electrophoretic analysis of total protein of Hippocampus.M：低分子量蛋白Marker；1、2：10 μL海马蛋白样品；3：5 μL海马蛋白样品

2.2 蛋白酶种类对海马总蛋白酶解的影响

不同种类的蛋白酶对海马总蛋白的水解度数据如表3，水解度从高到低依次为碱性蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶，选择水解度最大的一种酶作为最佳蛋白酶。海马总蛋白水解后的电泳结果见图2，其中泳道4为碱性蛋白，水解效果最好。因此，结合水解度和电泳结果可以得出对海马总蛋白酶解效果最佳的是碱性蛋白酶，后续实验选用碱性蛋白酶进行正交试验。

表3 4种不同蛋白酶对小海马总蛋白的水解效果

图2 不同种蛋白酶酶解海马总蛋白电泳分析Fig.2 Electrophoresis analysis of total protein from Hippocampus hydrolyzed by different proteases.M：极低分子量蛋白Marker；1：未酶解海马蛋白样品；2：木瓜蛋白酶酶解样品；3：中性蛋白酶酶解样品；4：碱性蛋白酶酶解样品；5：胰蛋白酶酶解样品

2.3 pH对海马蛋白水解度的影响

由图3可以看出在55 ℃，酶解3 h条件下，当 pH为7～9时海马蛋白的水解度随pH升高而不断升高，而当pH大于9时由于酶的活性受到影响，水解度也随之明显下降。 因此，pH为9时碱性蛋白酶对海马总蛋白水解效果最好，因此，选取8～10为正交试验pH范围。

2.4 酶解温度对海马蛋白水解度的影响

由图4可以看出在pH为9，酶解3 h的条件下，当温度为55℃时海马蛋白的水解度最大。因此，55℃为碱性蛋白酶的最适温度，正交试验选取50℃、55℃、60℃为正交试验温度范围。

图3 pH对海马蛋白水解度的影响Fig.3 Effect of pH on proteolysis of Hippocampus protein.

图4 酶解温度对海马蛋白水解度的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on proteolysis of Hippocampus protein.

2.5 酶解时间对海马蛋白水解度的影响

由图5可以看出在55℃，pH 为9的条件下，当酶解时间为3 h时海马蛋白的水解度最大。因此，确定3 h为碱性蛋白酶的最适时间，为正交试验提供了酶解时间范围为1 h、3 h和5 h。

图5 酶解时间对海马蛋白水解度的影响Fig.5 Effect of hydrolysis time on proteolysis of Hippocampus protein.

2.6 酶解E/S对海马蛋白水解度的影响

由图6可以看出在55℃，pH为9的条件下，当酶解E/S为4%时海马蛋白的水解度最大。E/S为4%为碱性蛋白酶的最适浓度比，为正交试验提供了酶与底物比例范围为3%、4%和5%。

图6 E/S对海马蛋白水解度的影响Fig.6 Effect of E/S on proteolysis of Hippocampus protein.

2.7 正交试验结果

通过对正交表的极差分析表明，对酶解海马蛋白水解度影响最大的是时间，其次是pH、温度和E/S(表4)，最佳水平组合为：A2B3C1D2。因此，碱性蛋白酶的最佳酶解条件为：pH为9、E/S为5%、温度为50℃、时间为3 h。在最佳酶解条件下，验证海马蛋白的水解度得出：海马蛋白的水解度达到了96.9%。

表4 正交试验分析结果

3 讨论

中药海马资源珍贵，活性成分丰富，尤其是含有丰富的蛋白质成分，为了实现对海马药物资源的高值化利用，对其蛋白质及其酶解后的多肽生物活性研究显得尤为重要[10]。因此，本研究采用水提法提取了海马总蛋白，并采用单因素和正交试验法优化蛋白酶及其酶解条件。盛琳等[11]采用4种不用溶剂提取海马有效成分，得出用水和醇两种溶剂可保证海马有效成分的得率。本研究主要是采用水提法来提取海马总蛋白，水提法提取的总蛋白较多，实验步骤简单、快速且不影响后续蛋白酶的活性。

本研究以水解度作为酶解指标，采用单因素和正交实验法相结合来优化酶解影响因素。目前关于海马蛋白酶解研究的报道不断增多，袁学会等[12]通过采用单酶对海马进行酶解工艺与清除DPPH工艺进行研究。陈成波等[13]研究了三斑海马液化蛋白的酶解提取工艺和酶解液的抗氧化活性。刘琪等[14]对海马的粉末经过中性蛋白酶酶解后发现其含有丰富的多肽和氨基酸，这些多肽和氨基酸具有抗氧化活性。姜展志[15]采用单酶和复合酶对海马蛋白进行了酶解条件优化，需先进行胰蛋白酶酶解再进行碱性蛋白酶酶解才能获得好的酶解效果，得出碱性蛋白酶最佳条件为酶解温度54.70℃、酶解时间6 h、酶解pH 8.99。本研究采用单因素对不同种蛋白酶进行优化，获得碱性蛋白酶为酶解海马蛋白的最佳酶，再经正交试验获得最佳酶解条件为：pH为9、E/S为5%、温度为50℃、时间为3 h。本文优化获得酶的种类、酶解pH和温度与姜展志[15]的报道相似，但时间缩短了50%，提高了酶解效率，且在最佳条件下仅采用碱性蛋白酶即可完全水解海马总蛋白，水解度达到96.9%，无需复杂的复合酶进行水解过程。

因此，本研究获得酶解海马总蛋白的最佳条件，可为海马资源的深入开发利用和海马多肽的生物学功能研究提供坚实的基础。

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Extraction and Optimization of Hydrolysis Conditions of Total Protein fromHippocampus

HU Jiayao, ZHANG Meiyan, WANG Zhenling, WEI Na, GAO Bingmiao*

HainanProvincialKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentofTropicalMedicinalPlants,HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China

In order to extract total protein ofHippocampusand optimize conditions for enzymatic hydrolysis, we extracted the total protein ofHippocampusby the method of water extraction of driedHippocampus. Papain, alkaline protease, neutral protease and trypsin were used respectively under the different pH, time, temperature and E/S conditions to conduct single factor test, and finally the enzymatic hydrolysis conditions were optimized by orthogonal test. The enzymatic hydrolysis condition and protein content under different conditions were determined by SDS-PAGE and BCA, respectively. The optimal enzymolysis conditions were determined according to the degree of proteolysis shown in the charts. The results showed that 1.056 g total protein was extracted from 10 g driedHippocampus, and its protein concentration was 0.106 g/mL. The best enzyme was alkaline protease. The best enzymatic conditions were pH 9, E/S 5%, hydrolysis temperature 50℃and hydrolysis time 3 h, and the degree of hydrolysis of theHippocampusprotein was 96.9%. The optimal enzymatic hydrolysis conditions have been determined, and the study laid a certain foundation for the study of biological activity of hippocampal polypeptide.

Hippocampus; protein; hydrolysis conditions; optimization

2017-02-21; 接受日期：2017-03-20

国家自然科学基金项目(81560611)；海南省大学生创新创业训练计划项目(20150084)；海南医学院创新性实验计划项目(hycx2014060)资助。

胡佳瑶，本科生，研究方向为海洋药物。E-mail: 61587122@qq.com。*通信作者：高炳淼，副教授，研究方向为南药与海洋药物资源开发。E-mail: gaobingmiao@qq.com

10.19586/j.2095-2341.2017.0011