谢玉龙, 石仝雨, 缪伟伟, 王志雄,2*

1.上海理工大学医疗器械与食品学院, 上海 200093; 2.上海健康医学院药学院, 上海 200237; 3.日本国大阪大学医学研究科, 日本大阪府吹田市 565-0871



正交实验法优化超临界二氧化碳萃取桑叶总黄酮

谢玉龙1, 石仝雨1, 缪伟伟2,3, 王志雄1,2*

1.上海理工大学医疗器械与食品学院, 上海 200093; 2.上海健康医学院药学院, 上海 200237; 3.日本国大阪大学医学研究科, 日本大阪府吹田市 565-0871

探索采用超临界CO2法萃取桑叶中总黄酮提取的最佳方案。利用超临界二氧化碳萃取技术，依次用正交实验方法考查萃取压强、萃取温度、萃取时间以及夹带剂流速对于桑叶中总黄酮得率的影响，优选提取桑叶黄酮类化合物提取的最佳工艺条件。结果显示，正交实验的最佳萃取条件为：萃取压强为25 MPa，萃取温度为40℃，萃取时间为3 h，夹带剂无水乙醇流速为2.5 mL/min，该条件下，总黄酮得率为6.19%±0.26%，可重复性良好。采用超临界二氧化碳萃取桑叶中黄酮类物质的总黄酮提取率较高，为进一步开发桑叶实验提供了理论和实验依据。

桑叶;超临界萃取技术;总黄酮得率;正交实验法

目前已有多种传统中药被证实对于对多种疾病的预防与治疗具有良好功效[1,2]。桑叶作为一种低价、易得的中国传统中药材[3]，在我国拥有丰富的资源。桑叶中含有多种营养成分，主要包括维生素、矿物质、氨基酸、黄酮类、生物碱类和多糖等，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老、抗肿瘤、提高免疫力等药理学作用[2～5]。但是目前在针对桑叶相关药用成分的提取方面却尚未有详细研究[4]。

黄酮类化合物是桑叶的主要功能性成分之一，其中包括芸香苷、槲皮素、异槲皮素、二氢山萘素等成分，相比一些传统的中药，桑叶中的总黄酮成分具有比较高的药用价值[6～8]。超临界二氧化碳流体(supercritical CO2fluid extraction，SFE-CO2)萃取方法是一种新兴技术，目前在国际上属于最先进的物理萃取分离技术之一[9]。本研究采用正交实验法优化超临界二氧化碳萃取桑叶总黄酮成分，研究获得其最佳萃取条件，以期为进一步开发和利用桑叶中的总黄酮成分提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

桑叶干粉(日本野姬和株式会社)；芦丁标准品(金穗生物公司)；无水乙醇、九水硝酸铝(广州化工)、氢氧化钠(广州化工)、亚硝酸钠(广州化工)均为分析纯；二氧化碳(纯度99.999%)；50 mL离心管；超纯水(自制)、100 mL容量瓶；200 mL量筒；10 mL量筒，移液枪；15 mL离心管；0.45 μm过滤器，漏斗；滤纸；石英比色杯。

紫外可见光分光光度计(756P上海光谱仪器有限公司制造)；超临界二氧化碳流体萃取设备(美国Waters设备有限公司)；恒温水浴箱(CV-420，上海恒一精密仪器有限公司)；超纯水系统(RE-100，上海本昂科学仪器有限公司)；电子天平(FA2104，上海舜宇恒平)。

1.2 工艺路线

称重干燥后的桑叶粉2 g，装入超临界萃取装置的萃取釜中，根据相关的参考文献，本试验选用无水乙醇作为夹带剂[10]。在试验中通过改变相关的萃取参数，根据实验设定的条件完成相关萃取，获得总黄酮提取液，并且计算得到总黄酮提取率。具体步骤：桑叶→干燥→称重→超临界萃取→总黄酮提取液→测定总黄酮提取率。

1.2.1 标准曲线的绘制 按照《药典》2010版中所述方法[11]，精确称取干燥至恒重的芦丁标准品5.0 mg置于50 mL容量瓶中，用无水乙醇超声溶解，摇匀，定容至50 mL，使之成为浓度100 μg/mL的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。精密量取上述溶液0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置于10 mL容量瓶。加5%亚硝酸钠水溶液0.3 mL，放置6 min，加10%硝酸铝0.3 mL，混匀后放置6 min，加入1%氢氧化钠溶液4 mL，混匀，放置15 min后，加无水乙醇定容至10 mL，静置15 min，等待显色后用紫外可见分光光度计，根据相关文献在λ=510 nm波长处测量吸光度[10]，试剂空白为对照，芦丁标准品的浓度为横坐标，510 nm处的吸光度为纵坐标作图,绘制标准曲线[11,12]。

1.2.2 桑叶提取液样品的制备 精密称取干燥至恒重的桑叶药材粉末2 g，投入萃取釜中，按照相关的实验要求在Water萃取设备配套软件界面设定所需萃取温度、压强、夹带剂流速。当制冷机温度逐步降至3℃左右时，系统开始加入夹带剂，同时对系统进行加压，CO2由气瓶进入冷凝器变为液态，通过配套的高压泵计量注入萃取釜中，逐步升温进入超临界状态进行萃取。当达到所设定的压力值时，系统开始循环萃取，并保持恒温恒压。携带有桑叶萃取物的二氧化碳体依次进入分离斧Ⅰ和Ⅱ，由节流阀控制逐级降压并改变温度，桑叶萃取物与CO2自行分离。当达到所选定的时间后，逐步释放萃取釜的压力到常压，打开取料口，获取桑叶提取液[13],并在下一步的实验中将桑叶提取液作为供试品溶液。

1.2.3 总黄酮提取率的计算 量取1 mL供试品溶液于10 mL容量瓶，按绘制1.2.1项芦丁标准曲线时的相关步骤显色，直接于510 nm波长处测定吸光度，获取供试品总黄酮浓度。然后根据下列公式，计算总黄酮提取率[13]。

C：提取液总黄酮的浓度(mg/mL)；V：提取液定容后的体积(mL)；M：称取的样品桑叶干粉的质量(mg)。

1.3 单因素实验

根据相关文献[10～12]和美国Waters公司二氧化碳萃取仪器的使用说明书，得到影响总黄酮得率的主要因素有萃取温度、压强、萃取时间和夹带剂流速。在本研究采用这4个因素水平进行单因素试验，分别考察各因素对桑叶黄酮得率的影响，具体如表1所示。

1.4 正交实验设计

根据相关文献[14,15]，影响超临界萃取的主要因素有4个，主要是萃取压力、萃取温度、萃取时间和夹带剂流速，本研究以单因素实验为基础，建立4因素3水平的正交试验分析上述因素对总黄酮得率的影响，具体的设计表2所示，分别考察各水平对桑叶黄酮得率的影响。

1.5 实验数据分析

通过SPSS 19.0软件进行统计分析处理，采用Sigmaplot 10.0和Excel 2007绘图。

表1 单因素试验因素及水平

表2 L9(34)正交实验因素表

2 结果与分析

2.1 标准曲线

利用SPSS 19.0统计软件，算出回归方程为：y=0.012 3x，R2=0.999 4(图1)，表明在该范围内，芦丁标准品浓度与吸光度值线性关系良好。

图1 芦丁标准溶液曲线Fig.1 Standard solution curve of rutin.

2.2 单因素实验

图2 单因素试验结果Fig.2 Results of single factor experiment.

根据表1中的单因素试验及水平所得结果见图2。由图2可知，萃取温度45℃、提取时间2.5 h、萃取压强为35 MPa和夹带剂流速为2.5 mL/min为各单因素的最大响应值。故在下文中以此为基础条件，设计因素水平，进行提取工艺的优化。

2.3 正交实验

根据实验结果分析，由表3可以看出：对总黄酮得率的影响大小顺序为C>A=D>B，即萃取时间>萃取压强=夹带剂无水乙醇流速>萃取温度。其中萃取时间对总黄酮得率的影响最大，其次是萃取压强和夹带剂流速，并且萃取的最优化组合为A2B1C3D2，即最优工艺为萃取压强为25 MPa，萃取温度为40℃，萃取时间为3 h，夹带剂无水乙醇流速为2.5 mL/min。

2.4 工艺验证性实验

根据正交实验优化的最佳方案为：萃取压强为25 MPa，萃取温度为40℃，萃取时间为3 h，夹带剂无水乙醇流速为2.5 mL/min，按照该实验要求进行3组平行实验，得到总黄酮得率结果为6.19%±0.26%，可以证明采用正交实验法优化得到的提取条件参数基本准确可靠，可重复性良好，具有一定的实用价值。

3 讨论

桑叶作为中国的民间传统药用植物，含有大量的黄酮类成分，黄酮类物质具有降脂、降糖、降低血压以及改善人体血液循环等多种生理活性，在抑制癌症、抗击衰老等方面也发挥着重要作用，其在医药领域具有极广阔的应用前景。

传统萃取桑叶中的总黄酮的方法主要有：回流提取法、超声提取法、微波提取法、索氏提取法[16,17]等。但是上述方法都存在需要较高的温度、总黄酮提取率相对较低、萃余物质存在大量的溶剂残余等缺陷。相比而言，超临界CO2萃取方法具有能够在较低温度条件下实现桑叶中总黄酮物质的高效提取、萃取液中能够保留多种具有生理活性的总黄酮成分、萃余物无有机溶剂残留、流程简单、操作相对简单、可保护桑叶总黄酮中热敏性物质不受破坏等特点。其工艺特征能够很好的解决上述工艺缺陷。本文利用超临界CO2萃取技术和紫外可见分光光度法测定了桑叶提取液中的总黄酮提取率为6.19%±0.26%，根据一系列验证性实验，该实验结果准确度高，偏差较小，为开发和科学利用桑叶中的有效成分提供了相关实验依据，也为今后测定桑科植物中总黄酮的含量提供了实验和理论依据。

表3 正交实验结果表

[1] 中国药典委员会. 中国药典[M]．北京：中国医药科技出版社，2015，297-298.

[2] Park S, Kim J, Kim Y. Mulberry leaf extract inhibits cancer cell stemness in neuroblastoma[J]. Nutr. Cancer, 2012,64 (6):889-898.

[3] 宿树兰，段金廒，欧阳臻，等.我国桑属(Morus) 药用植物资源化学研究进展[J].中国现代中药，2012,14(7):1-6.

[4] 王雯熙,杨红建,薄玉琨,等. 不同品种桑叶营养成分分析与代谢能值评定研究[J]. 中国畜牧杂志,2012,03:41-45.

[5] Doss S, Chakraborti S, Chattopadhyay S,etal.. Physiological and biochemical characteristics associated with leaf retention in mulberry (Morusspp.)[J]. Open J. Genet., 2011,1:27-33.

[6] 孙 玲. 桑叶的化学成分、 研究方法及药理活性研究进展[J].临床合理用药，2012,5(28)：178-179.

[7] 朱自强．超临界流体技术原理和应用[M].北京：化学工业出版社，2010.

[8] 张丽洁，张 志. 桑叶的药理作用及临床应用[J].中医中药，2010,17(29)：80-81.

[9] 林英男，时 伟.超临界CO2提取桑叶中总黄酮的工艺研究[J].齐鲁工业大学学报，2014,28(3)：32-36.

[10] Ye W. Development features of supercritical(ultra-supercritical) technology in the world and experiences we can learn[J]. J. Power Energy Engin.,2016, 4:1-3.

[11] 李佳慧,拱健婷,赵丽莹,等.黄蜀葵花总黄酮提取工艺[J].国际药学研究杂志,2016(2):370-373.

[12] 马泽刚,袁小红,徐春霞,等.费约果叶片总黄酮的提取工艺研究[J].食品研究与开发,2016(9):79-82.

[13] 王建权,李奎永.大血藤总黄酮分离纯化工艺研究[J].新中医,2016(4): 275-277.

[14] 谢丽芬,王海东,姜水红,等.凉茶中总黄酮含量测定方法的研究[J].食品科技,2016(8):265-267.

[15] Al-Asheh S, Allawzi M, Al-Otoom A,etal.. Supercritical fluid extraction of useful compounds from sage[J]. Nat. Sci., 2012, 4: 544-551.

[16] Allawzi M, Al-Otoom A, Allaboun H,etal.. CO2supercritical fluid extraction of jordanian oil shale utilizing different co-solvents[J]. Fuel Proc. Technol., 2011,92(10):2016-2023.

[17] 何 晶，钱斐莹，邹 培，等．不同提取方法对桑叶中芦丁含量的影响研究[J]．广东化工，2016，43(17)：18-19.

Optimizing of Supercritical Carbon Dioxide Extraction of Flavonoids Ingredients from Mulberry Leaf by Thogonal Experiment Method

XIE Yulong1, SHI Tongyu1, MIAO Weiwei2,3, WANG Zhixiong1,2*

1.SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China; 2.PharmacySchool,ShanghaiUniversityofMedicineandHealthSciences,Shanghai200237,China; 3.GraduateSchoolofMedicine/FacultyofMedicine,OsakaUniversity,Osaka565-0871,Japan

The intent of this study is to explore the best solutions for the supercritical CO2extraction of flavonoids from mulberry leaves. This study used supercritical carbon dioxide extraction technology, detected the effects of extraction pressure, extraction temperature, extraction time, entrainer flow on the yield of total flavonoids in mulberry leaves through orthogonal experiment method, to optimize the best process conditions. Results showed that: orthogonal experiment for the optimum extraction conditions were as follows: extraction pressure was 25 MPa, extraction temperature was 40 ℃, extraction time was 3 h, entrainer anhydrous ethanol velocity was 2.5 mL/min. The expected flavonoids yield rate was 6.19%±0.26%, the repeatability was good. Flavonoids extraction rate by the supercritical carbon dioxide extraction from mulberry leaves was high. This study provided theoretical and experimental basis for further development of mulberry leaf.

mulberry; supercritical carbon dioxide extraction; flavonoid yield; thogonal experiment method

2016-11-03; 接受日期：2016-12-02

国家自然科学基金项目(81402030)资助。

谢玉龙，硕士研究生，研究方向为生物医学工程。E-mail：1609081872@qq.com。*通信作者：王志雄,高级工程师,研究方向为生物医学工程。E-mail:wangzx@sumhs.edu.cn

10.19586/j.2095-2341.2016.0127