曹洪玉 史 飞 唐 乾 郑学仿＊,1,,3

激光诱导游离色氨酸对血红蛋白反应动力学影响及机理

曹洪玉＊,1,3史 飞2唐 乾1,3郑学仿＊,1,2,3

(1大连大学生命科学与技术学院，大连 116622)
(2大连大学环境与化学工程学院，大连 116622)
(3大连大学，辽宁省生物有机化学重点实验室，大连 116622)

血红蛋白活性中心铁卟啉具有环状共轭结构，类似于叶绿素，可以吸收特定波长光，光会诱导铁卟啉发生氧化还原反应。研究中发现，紫外区波长光照射血红蛋白的氧化还原反应情况优于铁卟啉特征吸收波长(406 nm)光照射情况。无游离色氨酸(Trp)时，266 nm激光激发后高铁血红蛋白(metHb)、脱氧血红蛋白(deoxyHb)、氧合血红蛋白(HbO2)和碳氧血红蛋白(HbCO)均被激发至各自相应的激发态，其Soret带谱峰衰减至基态的时间大致相同；加入游离Trp后，激发态Trp会转移能量到铁卟啉，在直接和间接光能量双重作用叠加下，激发态铁卟啉衰减时间发生变化。metHb、deoxyHb和HbCO衰减时间明显延长，但对HbO2影响相对较小。根据瞬态吸收光谱、动力学曲线和紫外-可见吸收光谱综合分析可知，在加入游离Trp前后，4种形态血红蛋白在被入射光激发后，铁卟啉均反应至具有(或近似具有)一空位的铁六配位平面卟啉结构状态。

血红蛋白；铁卟啉；激光诱导；色氨酸；能量转移

0 引 言

在哺乳动物的生命活动过程中，金属蛋白中的铁卟啉蛋白有着非常重要的输氧、储氧、电子传递、生物催化及生物传感等生物功能[1-2]，如肌红蛋白(Mb)可从细胞外围运输氧气到线粒体末端[3-4]；Cyt c则是生物体中电子传递链的重要组成部分，在生物体内进行可逆的电子传递反应[5]。血红素蛋白中的铁卟啉活性中心是一个环状共轭结构，类似于叶绿素，能够吸收特定波长的光，光可诱导铁卟啉活性中心的结构发生变化，进而会影响血红素蛋白生物功能的表达，因此近年来光诱导血红素蛋白的研究也开始受到关注[6-15]。血红蛋白(Hb)是血红素蛋白的一种，它是红细胞内非常重要的呼吸蛋白，它的相对分子量约为64 500，分子内有4条多肽链，每个多肽链含有一个光电活性的血红素铁辅基[16]。近年来研究者多关注血红素蛋白中心铁卟啉新功能并期望仿生利用于电子转移反应、生物传感技术以及电催化作用等领域[17]。

肉类腐败是从表层血红蛋白和肌红蛋白的铁卟啉氧化变色开始的，如果对表层进行合适的紫外可见光光照，保持表层血红素蛋白氧结合状态，可以保护肉类质量，因此这一研究有重要应用前景[14-15]。Sakai等[7]发现在氩气环境下，355 nm激光能够诱导还原高铁血红蛋白(metHb)，添加的游离色氨酸(Trp)能够促进高铁血红蛋白的光致还原，并认为电子可能是从卟啉环转移至铁。Bartocci等[18]认为铁卟啉轴向配体可以作为电子供体，其提供电子还原卟啉环中心铁，还有研究者[19-20]认为氨基酸残基特别是色氨酸残基是光诱导还原反应的电子供体。氨基酸是生物体内必需的内源性小分子物质，经常作为小分子配体参与到生命活动中。芳香族氨基酸(如色氨酸、酪氨酸等)吸收特定波长紫外光后，可发出波长能量低于吸收波长的光[21-23]，发出的光可被铁卟啉吸收。我们在研究同为血红素蛋白的肌红蛋白时，发现用不同波长的氙灯光照射加入游离氨基酸的高铁肌红蛋白溶液时，游离氨基酸浓度的增加有利于metHb的光照还原，且在不同波长光照下对metHb的光照还原有不同的影响，含-OH或-SH基团(Tyr、Cys)的氨基酸对光照还原metHb有较好的促进作用，并推断出光还原的整个过程可能是分子间电子转移和清除自由基的过程[24]。光诱导蛋白内铁卟啉氧化还原及其引起的蛋白结构变化方面的研究虽已有初步相关报道[7,12-15,24-25]，但至今光诱导还原反应的机理尚不清楚，主要难点是在反应过程中电子的传递和瞬态蛋白结构的变化。因此，我们采用激光闪光光解、瞬态吸收光谱测定反应的动力学过程和中间体，结合紫外、荧光等稳态方法进一步研究游离Trp对光诱导血红蛋白氧化还原反应的影响及机制，对于探究光诱导反应中的能量转移和电子传递过程具有一定的启示作用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：V-560紫外-可见分光光度计(日本Jasco公司)，pHS-3TC酸度计(上海雷磁分析仪器厂)，LP-980激光闪光光解仪(Edinburgh Instruments，UK)，FA-1004电子天平(上海精科天平厂)。

试剂：人血红蛋白 (购于美国Sigma公司)，其UV-Vis吸收光谱特征表明样品绝大多数为高铁血红蛋白，使用时未经进一步的提纯，将其溶解在pH=7.4浓度为 0.01 mol·L-1的磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲溶液(phosphate buffer,PB)中，配成浓度为1×10-4mol·L-1的储备蛋白溶液(避光4℃保存并尽快用于实验)。实验中所用的蛋白溶液浓度为2.5μmol·L-1。在0.01 mol·L-1的PB中配制成浓度为0.01 mol·L-1的Trp溶液。实验中所用氧化剂为0.1 mol·L-1的铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])溶液，实验中所用还原剂为1 mol·L-1的连二亚硫酸钠 (Na2S2O4)溶液，实验中用水为去离子水。分别取一定量的高铁血红蛋白溶液，向其中加入适量的连二亚硫酸钠溶液将其还原为脱氧血红蛋白(deoxyHb)；向定量脱氧血红蛋白溶液通入高纯O215 min(每秒钟2～3个气泡)，得氧合血红蛋白(HbO2)；向定量脱氧血红蛋白溶液通入高纯CO 15 min(每秒钟2～3个气泡)，可得碳氧血红蛋白(HbCO)[26]。

1.2 实验内容

1.2.1 紫外-可见吸收光谱

移取2 mL已处理好的蛋白溶液于1 cm石英比色皿中进行测定，测定条件为：狭缝宽度2 nm，扫描波长范围220～700 nm，扫描速率200 nm·min-1，响应时间中等。

1.2.2 动力学瞬态吸收光谱

移取2 mL已处理好的蛋白溶液于1 cm石英比色皿中进行测定，实验中用266 nm的脉冲Nd∶YAG激光照射样品；单个脉冲持续10 ns，且单个脉冲的能量1～10 mJ，氙灯作为检测光源。激发光(266 nm)由Nd∶YAG调Q激光器产生的三次和四次谐波提供，探测光由150 W氙灯提供，两束光垂直会聚在1 cm的石英比色皿上。瞬态物种信号经阵列Czerny-Turner单色仪分光，由Hamamatsu R928光电倍增管探测。再经由与激光闪光光解仪配套的L900软件转化为横坐标为波长，纵坐标为ΔOD的瞬态吸收光谱，其中ΔOD的表达式如下：

其中I0是激发态产生前透过样品的光强度，IT是激发态生成时或产生后短时间内透过样品的光强度。

1.2.3 动力学数据分析

动力学瞬态吸收光谱波长范围为250～700 nm，每5 nm采集1次，每次采集时间为1μs，为了阐明体系激发态弛豫过程的机制，对动力学瞬态吸收的相关数据进行了处理与分析，通过 Levenberg-Marquardt方程对所测样品瞬态吸收强度的衰减曲线进行了多指数拟合，方程表达式如下：

式中R(t)为样品衰减过程的数学表达式，A为额外的背景常量，指前因子Bi为曲线在时间零点的振幅，τi为组分的特征寿命参数。最终拟合指数方程由较小的χ2值和τ值标准差SD确定。

2 结果与讨论

2.1 血红蛋白的化学氧化与还原

血红蛋白铁卟啉活性中心的铁可以呈现出不同的价态，我们在使用前对样品蛋白进行了紫外-可见光谱的表征，发现其有明显的高铁血红蛋白特征吸收峰，分别在406、537、577和630 nm处。向血红蛋白样品中加入不同浓度的铁氰化钾溶液，待其反应一段时间后，进行紫外-可见光谱表征，发现随着铁氰化钾浓度的增加，蛋白406 nm处吸收峰逐渐升高，537和577 nm处吸收峰有所降低 (图1A)，这表明样品中大多数为高铁血红蛋白，还有少部分的为非高铁血红蛋白。

向血红蛋白样品中加入不同浓度的连二亚硫酸钠溶液，待其反应一段时间后，进行紫外-可见光谱表征，发现随着连二亚硫酸钠浓度的增加，蛋白406 nm处吸收峰先逐渐降低后红移到430 nm，537和577 nm处吸收峰先逐渐升高后又消失，在555 nm处出现新的吸收峰，630 nm处吸收峰逐渐降低。430和555 nm处吸收峰都是脱氧血红蛋白的特征吸收峰(图1B)，这表明弱还原剂连二亚硫酸钠能够将血红蛋白活性中心的三价铁还原为二价铁。

图1 氧化剂与还原剂对Hb紫外-可见吸收光谱的影响Fig.1 Effects of oxidizing agent and reducing agent on UV-Vis absorbance spectra of Hb

2.2 血红蛋白的光照还原

图2 不同定波长氙灯光照metHb 2 h后对metHb紫外-可见吸收光谱的影响Fig.2 Effects on UV-Vis absorbance spectra of metHb irradiated by xenon lamp for 2 h atdifferent fixed wavelengths

本实验首先研究不同波长氙灯光对血红蛋白光照还原情况的影响，实验选用氙灯分出的不同定波长(260、280、320、355和406 nm)的光照射血红蛋白样品2 h，测定其紫外-可见吸收光谱(图2)。经不同波长光照后，蛋白的Soret带406 nm处特征吸收峰强度均降低并有轻微的红移，在Q带537、577和630 nm处的特征吸收峰有明显的降低，其中260 nm波长光有最明显的还原效果，406 nm波长光的还原作用次之。406 nm处为铁卟啉Soret带的特征吸收峰，因此406 nm波长光易被吸收从而使蛋白被还原；260、280、320和355 nm等波长光也可还原metHb，且260 nm光照还原效果比406 nm光照还原效果明显，这可能与蛋白中含有的芳香族氨基酸(如Trp，Tyr)有关，还可能与诱导光能量的增强有关，因此在后续实验中我们设想加入游离Trp研究其对蛋白光照反应的影响。另外对照实验中，未光照的添加游离 Trp前后的血红蛋白紫外吸收谱图相同，说明游离Trp和血红蛋白是没有相互作用的。

2.3 266 nm激光照射后血红蛋白瞬态吸收光谱

2.3.1 血红蛋白瞬态吸收光谱

为了进一步探究血红蛋白的光还原过程，以及血红蛋白铁卟啉活性中心结构变化的情况，用266 nm激光照射metHb、deoxyHb、HbO2和HbCO溶液，得到不同时刻的瞬态吸收光谱(图3)。从图3中可以看出，在266 nm激光激发后，metHb在405 nm附近有吸收峰，deoxyHb在 430 nm附近有吸收峰；HbO2在415 nm附近有吸收峰；HbCO在420 nm附近有吸收峰。405 nm附近吸收峰为三价铁血红素的特征吸收峰，430 nm附近吸收峰为二价铁血红素的特征吸收峰，415 nm附近吸收峰为二价铁氧合态的特征吸收峰，420 nm附近吸收峰为二价铁与CO配位的特征吸收峰，各波长处的瞬态吸收值随时间延长吸收峰强度先增大后降低，metHb在598 ns时吸收峰强度为最大，且总体吸收峰强度变化幅度比其他3种形态蛋白大，deoxyHb、HbO2和HbCO分别在598、596和592 ns时吸收峰强度为最大。

图3 血红蛋白不同时间的266 nm激光闪光解瞬态吸收光谱Fig.3 Transient absorption spectra recorded at different time after 266 nm laser photolysis of Hb

图4 加入Trp(2μL)对血红蛋白激光闪光解瞬态吸收光谱的影响Fig.4 Effects of Trp(2μL)on the transient absorption spectra of Hb by laser photolysis

2.3.2 游离Trp对血红蛋白瞬态吸收光谱影响

血红蛋白本身有Trp，但因包埋在其他氨基酸中，受光影响较小，本实验向蛋白溶液中添加游离的Trp，由于我们的设备无法发射260 nm波长激光，因而采用也可以被Trp吸收的266 nm脉冲激光以激发含Trp的蛋白溶液体系，进一步探究游离Trp对光诱导血红蛋白还原过程的影响。

与未添加游离Trp血红蛋白的瞬态吸收光谱相比，游离Trp对激光诱导血红蛋白反应的瞬态吸收光谱有明显影响(图4)。metHb在405 nm附近吸收峰的强度明显增强，deoxyHb在430 nm附近吸收峰的强度也明显增强，HbO2在415 nm附近吸收峰的强度亦明显增强，而HbCO在420 nm附近吸收峰的强度变化较小；并且加入的游离Trp也影响了蛋白吸收峰最大强度的出现时间，metHb由598 ns提前至594 ns；deoxyHb提前2 ns，HbO2时间不变，HbCO延后4 ns，此3种形态蛋白均在596 ns时吸收峰强度为最大。加入游离Trp后各蛋白Soret带吸收峰位置并未发生明显变化，但瞬时最高吸收峰强度明显增加，表明激发态Trp与蛋白质之间进行了能量转移，使得卟啉环吸收峰强度增加。

2.4 激光诱导血红蛋白反应动力学过程

为了研究激光激发后血红蛋白的弛豫过程及结构变化情况，我们得到了血红蛋白的动力学衰减曲线(图5)，并通过Levenberg-Marquardt方程对动力学衰减曲线进行多指数拟合，根据χ2值和τ值标准差SD，最终选择单指数函数，各曲线拟合参数如表1所示。根据拟合数据可知，未添加游离Trp时metHb、deoxyHb、HbO2和HbCO激发态衰减时间是不同的，metHb激发态的存在时间较短，其他3种形态蛋白光激发后中间体寿命相对较长，表明各蛋白激发中间态是不同的，其衰减时间也相应是不同的；而加入游离Trp后，除HbO2衰减时间基本不变外，metHb、deoxyHb和HbCO激发态衰减时间明显延长，其中HbCO激发态衰减时间延长50.3%至21.34 ns。动力学拟合数据表明游离Trp能够影响蛋白的铁卟啉光照反应，加入的游离Trp改变了激光诱导metHb、deoxyHb和HbCO衰减过程中的能量转移过程，反应机理在2.7节详细阐述。

图5 血红蛋白的光激发后Soret带峰瞬态衰减曲线Fig.5 Soret band decay curves of Hb after photo-excitation

表1 血红蛋白光激发后Soret带峰动力学曲线多指数拟合参数Table 1 Multi exponential fitting parameters of the Soret band kinetic curve of Hb after photo-excitation

2.5 激光诱导后血红蛋白的紫外-可见光谱

我们同时测得了激光激发前后血红蛋白的紫外-可见吸收光谱，以确定其结构变化情况。由图6A可知没有添加Trp的metHb经266 nm激光照射后Soret带特征吸收峰由406 nm红移到411 nm，且吸光强度明显下降，Q带538 nm处特征峰吸收没有明显变化，576和630 nm处特征吸收峰几乎消失；加入Trp的metHb经激光照射后Soret带特征吸收峰略有下降，Q带538、576和630 nm处特征吸收峰明显增强，与无Trp时的反应趋势不同。这表明加入的Trp对光诱导metHb结构变化的影响较大，光诱导metHb的反应中应该存在着能量的转移，促使蛋白中铁卟啉受光激发后向平面型激发态转变。

由紫外-可见光谱图 6B可知未添加 Trp的deoxyHb经266 nm激光照射后Soret带特征吸收峰由430 nm蓝移到419 nm，且吸光强度明显下降，Q带555 nm处特征吸收峰消失，在540和570 nm处形成2个新的吸收峰；加入Trp的deoxyHb经激光照射后，Soret带特征吸收峰由430 nm蓝移到415 nm，且吸光强度明显下降，Q带555 nm处特征吸收峰消失，在540和576 nm处形成2个新的吸收峰。添加Trp前后蛋白谱峰的位置和强度都发生了一定的变化，这表明加入的Trp对deoxyHb的光诱导反应影响较大。

HbO2的Soret带特征吸收峰在415 nm，Q带特征吸收峰在540和575 nm，且吸收较强。未添加Trp和加入Trp的HbO2经266 nm激光照射后，Soret带特征吸收峰都红移到了420 nm，且吸光强度有所减弱；Q带540和575 nm处吸收峰都有明显下降，620 nm附近都有新的吸收峰出现，且峰强度和峰位置基本相同 (图6C)。这表明游离Trp对HbO2的光照反应影响较小，其动力学数据也表明游离Trp对HbO2的光照反应影响不大。

图6 血红蛋白经266 nm激光闪光解后的紫外可见光谱Fig.6 UV-Vis absorbance spectra of Hb after 266 nm laser photolysis

未添加Trp和加入Trp的HbCO经266 nm激光照射后，Soret带419 nm处特征吸收峰都没有发生峰的位移，Q带538和568 nm处吸收也都没有发生峰的位移；但加入Trp后，Soret带和Q带吸收强度明显增强(图6D)。这表明HbCO的结构相对较为稳定，在266 nm激光激发后，蛋白总体结构几乎不发生变化。这是由于与CO配位的铁卟啉存在反馈π键，使蛋白铁卟啉对Trp转移能量吸收能力较为平稳，因此加入Trp后其激发态衰减时间有较大延长。

2.6 光诱导血红蛋白二级结构的变化

蛋白质的远紫外CD光谱能够反映蛋白质二级结构的信息[27]，如图7所示，在192 nm附近有1个正的谱带，在208和222 nm附近有2个负的特征肩峰谱带，这是蛋白质α-螺旋结构的特征CD光谱。在血红蛋白中未加入和加入游离Trp时，光照前后蛋白192 nm附近的正吸收峰与208和 222 nm附近的2个负吸收峰的强度有所减弱，但峰形和肩峰的位置并未发生明显变化。这说明光照能够引起蛋白二级结构的变化，但并未引起蛋白的变性。

图7 血红蛋白经260 nm光照射前后的圆二色(CD)光谱图Fig.7 Circular dichroism(CD)spectra of Hb before and after 260 nm light irradiation

2.7 激光诱导血红蛋白结构变化的机制

综合以上图谱及数据讨论可知，尽管蛋白的初始形态大不相同，蛋白在光照后其铁卟啉光谱均发生了明显变化。光照未加入Trp的血红蛋白，发现除metHb的576 nm处吸收峰以肩峰形式出现外，其余各峰变化趋于相同；而光照加入Trp的血红蛋白，发现蛋白Soret带和Q带的谱峰，无论峰型、峰位置，还是峰的强度，其变化均趋于同一方向(图6)，且加入Trp对光照反应影响明显，趋向性更强。光激发蛋白后，其Q带540和575 nm附近的吸收峰出现或增强表明：4种形态血红蛋白经光照反应后，均趋向于形成一个异于上述4种蛋白铁卟啉的结构。据此我们推测了激光诱导 metHb、deoxyHb、HbO2和HbCO结构变化的可能机理(图8)。动力学数据(2.4节)和紫外-可见光谱(2.5节)表明游离Trp在蛋白的光照反应中有明显的能量转移过程，从而改变衰减时间。

未加Trp的metHb经激光照射，部分卟啉环π电子被激发到激发态，电子较为活跃，转移到三价铁中未满的d轨道上，紫外光谱表明形成二价铁卟啉；加入Trp，光照首先激发Trp，Trp激发态弛豫后返回基态时所释放的能量更适合被铁卟啉吸收，发生分子间能量转移，铁卟啉达到激发态，同样π电子被激发跃迁到激发态，再转移到三价铁中未满的d轨道上，形成二价铁卟啉，促进铁卟啉内部的电子传递过程，紫外-可见吸收谱图和瞬态吸收谱图表明铁卟啉形成具有一空位的六配位平面结构，动力学数据和反应时间(表1)也证实如上反应过程，如图8A所示。

图8 光诱导血红蛋白反应机理Fig.8 Photo-induced reaction mechanism of different forms of Hb

deoxyHb卟啉环中的亚铁具有五配位结构，铁与卟啉的4个N不在同一平面上，光照激发卟啉后，卟啉形成激发态平面型结构，再经弛豫返回基态，形成具有一空位的六配位平面结构 (图8B)。HbO2的第六配位被O2所占据，光照后蛋白铁卟啉反应至激发态，Fe-O的配位键增长，配位能力减弱，O2呈离去(或半离去)状态，铁卟啉转化为近似具有一空位的六配位平面结构(图8C)。HbCO的第六配位被CO所占据，由于Fe与C之间存在反馈π键，致使二者配位结合力较强，CO不易离去，但光照铁卟啉至激发态后，使Fe-C键增长，CO呈半离去状态，紫外-可见吸收谱图和瞬态吸收谱图表明铁卟啉转化为近似具有一空位的六配位平面结构 (图8D)。游离Trp存在时，均因激发态的Trp会发生能量转移过程，进而促使各种状态蛋白的铁卟啉吸收与其相应的能量，使各种状态蛋白光照反应至铁卟啉具有(或近似具有)一空位的六配位平面结构状态(图8)。

3 结 论

通过用紫外-可见光谱法研究在光照条件下高铁血红蛋白的光谱性质，发现在260、280、320、355和406 nm紫外光照射下，都会促使高铁血红蛋白的结构发生变化，且260 nm紫外光较易激发铁卟啉，进而发生光照还原反应，而铁卟啉Soret带最大吸收波长光被吸收后较难激发铁卟啉。运用266 nm激光闪光光解光谱法研究不同形态的血红蛋白(metHb、deoxyHb、HbO2和HbCO)的动力学过程，发现在未添加游离Trp时，metHb、deoxyHb、HbO2和HbCO的衰减时间都大致相同；而加入游离Trp后，除HbO2衰减时间基本不变外，metHb、deoxyHb和HbCO的衰减时间均有不同程度延长。这表明加入的游离Trp会影响metHb、deoxyHb和HbCO激发态衰减过程中的能量转移过程。游离Trp存在时，均因激发态的Trp会发生能量转移过程，进而促使各种状态蛋白的铁卟啉吸收与其相应的能量，使各种状态蛋白光照反应至铁卟啉具有(或近似具有)一空位的六配位平面结构状态。这些实验结果将有助于深入了解光诱导血红蛋白反应的能量转移和电子传递过程，为该类蛋白光照反应的实际应用提供实验基础。

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Effect and Mechanism of Laser-Induced Hemoglobin Reaction Kinetics with Free Tryptophan

CAO Hong-Yu＊,1,3SHI Fei2TANG Qian1,3ZHENG Xue-Fang＊,1,2,3
(1College of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)
(2College of Environmental and Chemical Engineering,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)
(3Liaoning Key Laboratory of Bio-Organic Chemistry,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)

With a circular conjugate structure and similar to that of chlorophyll,the iron porphyrin of hemoprotein can absorb specific wavelengths of light to induce its redox reaction and configuration changes.In our research,we found that the photo-induced redox reaction of hemoprotein with ultraviolet lights has more obvious effects than the reaction irradiated by the iron porphyrin characteristic absorption wavelength (406 nm). Irradiated by 266 nm laser,methemoglobin(metHb),deoxyhemoglobin(deoxyHb),oxygenated hemoglobin(HbO2) and carboxyhemoglobin (HbCO)with the absence of free tryptophan(Trp)can be inspired to their corresponding excited states and the decay processes to the ground state indicated with their corresponding Soret band peak have almost the same time.After adding free Trp,the energy of excited state Trp transfers to iron porphyrin. With dual energy superposition of direct light irradiation and indirect energy transfer,the decay time of excited state iron porphyrin varied in different hemoproteins.The significant prolongations of decay time are observed on the photo-irradiated metHb,deoxyHb and HbCO,while slight influences are detected on the photo-irradiated deoxyHb and HbO2.According to transient absorption,kinetics curve and UV-Vis absorption spectra,the iron-porphyrin of four forms of hemoglobin could be excited by incident light or by the energy transfer from excited state Trp,then decay to the state ofplane porphyrin structure and six-coordinated Fe with one ligand vacancy.

hemoglobin;iron porphyrin;laser-induced;tryptophan;energy transfer

O614.81；O644.12

A

1001-4861(2017)08-1339-10

10.11862/CJIC.2017.159

2017-02-23。收修改稿日期：2017-05-11。

国家自然科学基金(No.21571025，21601025，21271036，21601024)和辽宁省教育厅科学技术研究项目(No.L2013471)资助。

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