张相霞 郭振环 马 霞* 卞陆杰 刘永录 王文静 （山东省平邑县动物卫生监督所 273300 山东省滨州畜牧兽医研究院 河南牧业经济学院 河南 郑州）

蜂胶提取物体内外抑菌试验

张相霞①郭振环②马 霞②②*卞陆杰②刘永录②王文静②（①山东省平邑县动物卫生监督所 273300 ②山东省滨州畜牧兽医研究院 ②河南牧业经济学院 河南 郑州）

为研究蜂胶提取物的体外对大肠杆菌的抑菌作用及体内对鸡大肠杆菌病的防治效果。采用体外试验：采用打孔法，测定抑菌圈直径，采用2倍稀释法测定最小抑菌浓度；体内试验：本试验通过人工建立鸡大肠杆菌病模型，用蜂胶提取物进行预防治疗，同时设氟苯尼考西药对照治疗组。观察临床症状、体重变化等指标。结果表明，大肠杆菌对蜂胶提取物以及氟苯尼考均高度敏感，蜂胶提取物的MIC为0.013g/m1。蜂胶提取物预防及治疗组和西药对照组的治愈率和有效率差异不显著；蜂胶提取物组增加体重作用显著优于西药对照组。

蜂胶提取物 鸡大肠杆菌 体外试验 体内试验 抑菌

鸡大肠杆菌病的发病率和死亡率很高，不同品种不同日龄的鸡均可发病，给养鸡业造成极大的损失。抗菌药对本病虽有一定的治疗和预防作用，但由于其反复和大量应用，极易产生抗药性，且易造成药物残留影响食品安全[1]。中药具有疗效可靠、毒副作用小、不易产生有害残留等优势[2]，近些年来，中药天然产物提取物逐渐成为了国内外研究的热点话题，并且在畜禽饲料生产和养殖上受到了广泛的重视，以其无残留、无耐药性、天然抗氧化等特点成为了畜牧行业的代替抗生素的最佳选择[3]。

蜂胶是一种天然物质，是蜜蜂从植物树干及花苞上采集的树胶，混入其上颚腺分泌物和蜂蜡等物质而成的一种具有芳香气味的胶状固体物质，含有多种酮类、酸类、酚类等多种等化合物。研究表明，蜂胶具有抑制抗菌、抗肿瘤、降血糖、降血脂等作用[4]。本试验体外研究蜂胶提取物对大肠杆菌的抑菌作用及人工诱发鸡大肠杆菌病然后用蜂胶提取物进行预防治疗，旨在确认该药对鸡大肠杆菌病的疗效，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

蜂胶提取物(本实验室制备)、氟苯尼考(河南省康星药业有限公司产品)，规格500g:10g，批号11110602。

1.2 主要仪器

台式离心机(型号为TGL-16G)，购自上海安亭科学仪器厂；超净工作台(型号为BHC-130011H2)，购自苏州泰安空气技术有限公司；恒温振荡器(型号为HZ-9211K)，购自太仓市科教器材厂。

1.3 体外试验方法

1.3.1 菌种复活与鉴定 大肠杆菌O78株(C83890)，购自中国兽药监察所。先将菌种接种到GN增菌液中，放置37℃恒温摇床(180rpm/min)培养8h。然后无菌操作接种于麦康凯琼脂平板上，37℃培养16h。细菌呈边缘整齐、光滑、隆起的红色菌落。从麦康凯琼脂培养基上挑取单个的菌落用革兰氏染色后，在油镜下观察：有许多短杆状、单个散落的红色细菌。

1.3.2 对照药物的选取 用药敏纸片法[5]测定了临床常用的10种抗菌药对菌株的体外抑菌效果。结果，各抗菌药的抑菌圈直径(mm)分别为：丁胺卡那26；卡那霉素25；林可霉素0；强力霉素9；复方新诺明8；氨苄青霉素0；恩诺沙星8；阿莫西林0；氟苯尼考27；新霉素22。以氟苯尼考的抑菌效果最好，因此选择其作为对照药物。

1.3.3 抑菌圈直径测定 先将菌种接种到麦康凯琼脂平板上，37℃培养24h复壮。选择呈粉红色隆起、表面光滑的菌落，接种于新鲜营养肉汤，37℃培养24h。进行一定比例稀释后吸取150μl于普通营养琼脂平板内，用“T”形涂布棒涂匀。采用打孔法，用直径为6mm的打孔器在平板上打孔后，在酒精灯上加热封底，每板分别加入1种浓度的受试药品，以刚刚注满为准。37℃培养24h后测量抑菌圈直径大小。

1.3.4 最小抑菌浓度(MIC)测定 采用2倍稀释法。将蜂胶提取物在24孔板上作6孔倍比稀释后，每孔加入培养6~8h的菌液50μl，混匀后37℃培养24h，各孔肉汤转接普通营养琼脂平板，再培养24h，以无细菌生长孔的药物最大稀释度为该药的MIC。

1.4 体内试验方法

1.4.1 攻毒菌种与人工发病预试验 （1）攻毒预试：用麦氏比浊法调整菌液浓度为107、108、109、1010和1011CFU/ml；1日龄蛋公鸡180只饲喂至60日龄，随机均分为6组。空白对照组隔离饲养。其余5组，分别用稀释的大肠杆菌菌液胸肌注射0.5ml攻毒。每天观察鸡的临床症状，记录死亡数，剖检死亡鸡，取病料进行病原分离鉴定。观察至死亡停止后3d，统计各组的死亡率。确定大肠杆菌的合适攻毒剂量。（2）死亡鸡剖检可见，肝脏肿大质脆；肺炎性水肿，有出血点；胃黏膜脱落，胃壁有大小不一的黑褐色溃疡斑；结肠、盲肠的浆膜和黏膜充血或出血，肠内充满气体和胶胨样物。个别病例肝脏和心脏有局灶性坏死病灶。取病变明显脏器抹片革兰氏染色镜检为短杆状、单个散落的红色细菌。各组死亡率在0~100%之间，因正式试验时需要观察用药效果，死亡率太高不利观察用药效果，死亡率太低又不利比较不同剂量的药物治疗效果，所以选择109CFU/ml菌液浓度(死亡率为36.7%)为正式试验的攻毒菌液浓度。

1.4.2 试验动物及分组处理 1日龄罗曼蛋公鸡，购自河南省郑州市正德生物科技有限公司。饲养至60日龄选取250只，均分为5组，每组50只。空白对照组隔离饲养，蜂胶提取物预防组1%蜂胶提取物饮水7d后攻毒，其余3组每羽胸肌注射大肠杆菌液0.5ml攻毒(预实验攻毒菌液浓度109CFU/ml)后，蜂胶提取物治疗组1%蜂胶提取物饮水，西药对照组氟苯尼考粉混饲，阳性对照组不用药。试验期28天，其中用药期7d，用药后观察21d(表1)。

表1 试验动物分组处理

1.5 测定指标及方法

1.5.1 临床症状 每日观察记录：饮食情况、精神状况、拉稀状况、发病情况、死亡情况。

1.5.2 疗效评价标准 结合生长情况按如下标准综合判定疗效：痊愈：鸡只精神活泼，下痢停止，饮食完全正常。显效：鸡只存活，但精神、下痢及饮食等未完全恢复正常。有效率＝(痊愈数+显效数)÷样本数×100%。

1.5.3 体重变化 试验前(D0)及试验结束(D28)每组3个重复存活鸡分别称重统计增重情况。

1.6 数据处理与统计

百分率采用t检验，体重变化以Means±SD表示，用SPSS软件进行Duncan’s多重分析。

2 结果

2.1 体外抑菌效果

结果显示大肠杆菌对蜂胶提取物以及氟苯尼考均高度敏感，抑菌圈直径高于25mm。蜂胶提取物的MIC为0.013g/m1

表2 抑菌圈直径（mm）

2.2 总体疗效

蜂胶提取物组和西药对照组死亡率显著低于阳性对照组(P<0.05)；蜂胶提取物和西药对照组治愈率和有效率显著高于阳性对照组(P<0.05)，西药对照组的治愈率和有效率最高，但与蜂胶提取物组间差异不显著(P>0.05)(表3)。

2.3 试验前后体重变化

在试验开始D0，各组间体重差异不显著(P>0.05)。在试验结束D28，各攻毒组体重显著低于空白对照组，蜂胶提取物组显著高于西药对照组，西药对照组显著高于阳性对照组(P<0.05)(表4)。

表3 各组的总体疗效 （%）

表4 各组体重的变化 （g）

3 讨论

（1）大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种细菌性传染病。1885年，Escherich发现的大肠杆菌在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶发现一些特殊血清的大肠杆菌对人和动物有病原性，才引起人们的重视。目前，已知大肠杆菌的菌体(O)抗原171种，表面(K)抗原接近80种，鞭毛(H)抗原56种，因而构成了许多血清型，使动物临床症状表现复杂多样，且随着规模化养畜(禽)业的发展，病原性大肠杆菌成了目前养禽业最棘手的问题。（2）中兽医学有着悠久的历史和丰富的应用经验，在抗生素使用以前，对保障家畜健康起着重要作用。国内外研究证明，蜂胶提取物具有很强的抗菌作用，有“天然抗生物质”之称[6]。本研究体外药敏性试验结果显示，大肠杆菌O78株对蜂胶提取物及氟苯尼考均高度敏感。这表明蜂胶提取物能用于防治大肠杆菌病，这与申慧亭等[7]的研究结果一致。（3）体内试验结果显示，蜂胶提取物预防组对鸡大肠杆菌的治愈率和有效率稍高于西药对照组，而蜂胶提取物治疗组的治愈率和有效率虽然低于西药对照组但差异不显著，表明，蜂胶提取物对鸡大肠杆菌病有很好的预防治疗效果。（4）防治大肠杆菌病的关键在于贯彻“养重于防，防重于治”的方针。蜂胶提取物对鸡致病性大肠杆菌敏感，疗效明显、安全可靠；此药为纯中药制剂，具有无毒副作用；用量小，可用于饮水，使用方便等特点，可以用于鸡大肠杆菌病的预防治疗。

[1] 周军, 李红斌, 李睿鸿. 滥用抗生素对养猪业的危害及应对措施[J]. 当代畜禽养殖业, 2011, 6: 43-46.

[2] 温伟, 吕金良, 高振伟等. 浅谈现代中兽药的发展前景[J]. 中兽医学杂志, 2010, 1: 50-53.

[3] 李文强, 马春阳, 轩振等. 植物提取物在家禽抗氧化上的应用[J].现代畜牧兽医, 2014(11): 28-33.

[4] 顾青, 张燕平, 钟立人. 蜂胶中有效成分提取工艺研究[J]. 浙江农业学报, 2001, 13(3): 161-163.

[5] 王效田, 孔祥峰, 夏明龙等. 南京郊区奶牛乳房炎病原菌分离鉴定

及药敏试验[J]. 畜牧与兽医, 2004, 36(11): 6-8.

[6] 张芳英, 穆丽娟, 杨继章等. 蜂胶提取物的抗菌作用的研究进展[J].中国药房, 2011(11): 1041-1043.

[7] 申慧亭, 靳月琴. 蜂胶抗菌作用的实验室研究[J]. 长治医学院学报, 2005, 19(4): 253.

S896.6

A

1007-1733(2017)07-0009-03

2017–05–19）

河南牧业经济学院科技创新团队（HUAHE2015009），河南省中草药组培快繁及资源开发利用创新团队(C20150033)。

*通讯作者