赵桂省 马 莹 陈 甫 王洪举*（山东省济南市畜牧技术推广站 250306 青岛农业大学动物科技学院 山东 青岛）

试验研究

山东部分地区猪源隐孢子虫卵囊的分离与基因型鉴定

赵桂省①马 莹①陈 甫②王洪举①*（①山东省济南市畜牧技术推广站 250306 ②青岛农业大学动物科技学院 山东 青岛）

应用抗酸染色技术对山东地区部分猪场隐孢子虫感染情况进行检测，通过PCR扩增部分18s rRNA序列，分析同源性，并绘制基因进化树，鉴定其基因型。结果表明，648份猪粪样品的感染率为12.04%，隐孢子虫卵囊有两种形态，18s rRNA序列分析发现与C. parvum “mouse”型和C. muris有100%和99.8%的同源性，并分别处于同一分支。说明山东地区猪隐孢子虫感染率较高，感染的隐孢子虫基因型是C. parvum “mouse”型和C. muris，提示猪与鼠之间存在交叉传播的可能。

隐孢子虫 猪 PCR 基因进化树

隐孢子虫(Cryptosporidium)是细胞内寄生原虫，自从Tyzzer[1]在小鼠粘膜组织中发现小鼠隐孢子虫(C. muris)以来，包括中国在内，隐孢子虫已经在世界上六个大洲90个国家发现[2]。现今，隐孢子虫已经被认为是人和动物腹泻与胃肠炎的主要原因之一，对于免疫功能正常的宿主主要易受水源性威胁，引起的腹泻多为自限性的，而免疫功能受损的宿主，特别是AIDS病患者，腹泻多为严重的慢性感染并常常危及生命。一些水源性爆发的传播事件已经报道与家畜饲养和放牧有关[3,4]，Atwill等(1997)暗示猪粪可能是微小隐孢子虫(C.parvum)的重要传染源，Izumiyama等观察到断奶仔猪是C.parvum的重要传染源，而且可以通过饮水污染[5]，这也说明了猪在人类和其他动物感染中扮演着传染源的角色。现今，隐孢子虫的分子流行病学调查已成为隐孢子虫研究者研究的热点，国内关于猪隐孢子虫基因型鉴定的报道较少[3,6]。因此，本试验应用RT-PCR技术对改良抗酸染色法阳性的猪粪样品进行鉴定，扩增并测定小亚单位核糖体RNA(18s rRNA)部分序列，分析同源性，并绘制出基因进化树。

1 材料与方法

1.1 试剂 5% K2Cr2O7溶液，饱和盐水，PCR试剂盒(TaKaRa)；抗酸染色液[7]。

1.2 仪器 生物显微镜，台式离心机，PE-2400型PCR扩增仪(Thermo Forma)，ZF-4型紫外反射透射仪，DC120型凝胶成像系统，Minirum型电泳仪(Thermo Forma)等。

1.3 样品采集与处理 648份猪粪样品分别采自山东4个地区的猪场，分别按调查场中的猪圈数按一定比例随机采集，保存于5% K2Cr2O7溶液中，备用。

1.4 实验室检查 将保存于5% K2Cr2O7溶液中的粪便5 g研磨过筛(孔径63μm)，除去大的粪便颗粒，滤液经1500rmin-1，离心10min，弃上清。沉淀加入10ml饱和盐水充分混匀，500rmin-1，离心10min，取上清，用0.01mol·L-1PBS洗涤2次，悬浮于200μl PBS中，4℃保存。取20μl涂成直径为1cm大小的圆，火焰固定，乙醚去脂3min，经甲液染5min，10%硫酸中脱色30s，孔雀石绿染色，显微镜下观察。

1.5 PCR鉴定 将分离纯化的卵囊反复冻融3次，提取总DNA。根据18srRNA基因设计引物：5`-ggaagggttgtatttatta gataaag-3`和5`-aaggagtaaggaacaacctcca-3`。采用25μl扩增体系(上下游引物各1μl，2×PCRmix 12.5μl，模板2μl，ddH2O 8.5μl）。扩增条件为：94℃预变性7min；94ºC变性0.5min，56℃退火0.5min，72ºC延伸1min，共40个循环；最后72℃延伸10min，4℃保持。取5μl PCR产物与1μl电泳上样缓冲液进行电泳，取凝胶在紫外透射仪下摄影。

1.6 测序及分析 用TaKaRa琼脂糖凝胶纯化试剂盒和核酸共沉剂纯化浓缩DNA片断，分离的DNA片断连接到pMD18T载体上，由大连TaKaRa生物工程公司测序，应用DNAStar软件中的SeqEd、MegAlign程序分析分离株与下列隐孢子虫18s rRNA基因相同位置的序列同源性，并绘制系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 隐孢子虫卵囊形态 卵囊呈圆形、扁圆形或椭圆形，最外层有一薄的卵囊壁，内部有呈月牙形的子孢子，圆点状的残留体，个别卵囊呈空泡状(图1)。经MAFS染色的卵囊在黄绿色蓝绿色背景下呈粉红色至玫瑰红色(图2)。

2.2 感染率 在采集的648份猪粪样品中，78份检测到卵囊，总阳性率为12.04%。在采集的4个地区中，感染率之间差异不显著(P>0.05)(如表1)。感染强度从“+”到“+++++”，分别为66.86%、17.98%、9.65%、4.49% 和1.12%，感染强度是“+”和“++”占了总感染率的84.84%。

图1 隐孢子虫卵囊在40倍光学显微镜下的状态

图2 经MAFS染色的隐孢子虫卵囊呈玫瑰红色(100×)

2.3 序列测定及基因进化树分析 分离株通过基因序列同源性对比分析发现，其中分别有4个(Z1-3，6)和2个(Z4，5)序列是100%一致的，故分离到2个分离株，部分18s rRNA序列之间同源性达96.5%。与其他的隐孢子虫序列相比，这2个分离株序列分别与C. parvum和C. muris是同一或接近的。其中Z1-3、6与“mouse”型C. parvum基因型(AF108863)同源性分别为100%，Z4、Z5与C. muris同源性为99.5%，如图3~4所示。

表1 猪隐孢子虫感染情况 （%）

图3 隐孢子虫基于部分18s rRNA基因序列的系统发育进化树

3 讨论

（1）自从猪隐孢子虫病在1977年由Bergeland和Kennedy等[8]在患有坏死性肠炎病猪中发现了第1例病例以来，隐孢子虫在不同地区和国家的猪场都有报道和流行，但是感染率报道不一[9]。国内不同地区猪隐孢子虫的感染率为1.12%到89.7%[10-14]。本试验中山东部分地区猪场隐孢子虫感染率为12.04%，各地区感染率之间差异不显著，且多为低强度感染。Quilez 等[15]报道西班牙集约化猪场隐孢子虫感染率为21.9%；Olson等[16]报道加拿大6个猪场中有4个猪场发生感染，总感染率为11%；Sanford和Xiao等报道安大略湖猪总感染率为5.3%[17]；Yu等[18]调查韩国Judok-eup地区589份猪粪中62份是阳性(10.5%)。说明隐孢子虫感染存在地域性特点。（2）过去一直认为只有C. parvum一个种，随着近年来对隐孢子虫分子生物学研究进展，现今已有15个被公认为单独有效的种，接近有23个隐孢子虫种或基因型也已被描述[5]，而且发现C. parvum种内存在不同的基因型，动物会感染其他的遗传清晰并且有明显宿主适应性的隐孢子虫基因型，如微小隐孢子虫“dog、mouse、monkey 和 rabbit”基因型[3]。其中，猪除了感染C. parvum “pig”基因型(C. suis)外，还能感染C. parvum “cattle”基因型、C. hominis和C. meleagridis等[17]。本研究发现分离的两株隐孢子虫Z1-3、6其形态与微小隐孢子虫特征相似，特别是卵囊的形态与微小隐孢子虫相近，初步确定此分离株为微小隐孢子虫；通过隐孢子虫部分18s rRNA基因序列分析发现，此分离株与微小隐孢子虫有99.1%~100%的同源性，尤其与微小隐孢子虫“mouse”基因型存在100%的同源性，且处于同一分支，从而确定了此分离株为微小隐孢子虫 “mouse”基因型。Z4-5其形态与C. muris特征相似，部分18s rRNA基因序列分析发现，此分离株与C. muris有99.5%的同源性，且处于同一分支，从而确定了此分离株为C. muris。丁玲报道，陕西省部分地区猪场感染的是猪隐孢子虫(C. suis)和猪基因Ⅱ型(C. scrofarum)[19]；Chen和Huang报道江苏和上海猪感染的是微小隐孢子虫“mouse”基因型[20]；谢小凡报道，重庆市猪隐孢子虫种是猪隐孢子虫(C. suis)[21]；陈兆国报道，上海地区猪隐孢子虫为C. suis和猪基因Ⅱ型[22]。基因型的不同可能与地理位置和猪品种有关。

总之，本研究发现山东地区猪隐孢子虫的感染率较高，基因型是微小隐孢子虫“mouse”基因型和C. muris，两种隐孢子虫首次均是在鼠类中发现的[1]，说明山东猪与鼠之间存在隐孢子虫交叉感染的可能，这为隐孢子虫的分子流行病学研究提供了重要依据。

[1] Tyzzer E. A sporozoan found in the peptic glands of the common mouse[J]. Proc Soc Exp Biol Med, 1907, 5:12-13.

[2] 邵兆霞, 张龙现, 宁长申等. 隐孢子虫病治疗研究进展[J]. 中国人兽共患病杂志, 2005, 21(10): 906-909.

[3] 陈甫, 黄克和. 猪源隐孢子虫卵囊的分离及基因型鉴定[J]. 中国兽医学报, 2011(2): 213-216+221.

[4] 陈甫, 黄克和. 保存在自来水中的微小隐孢子虫卵囊活性及感染性研究[J]. 中国兽医学报, 2010(4): 473-476.

[5] 张晓, 武利平, 吕静婷等. 我国部分城市水源水及末梢水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的污染状况调查[J]. 环境与健康杂志, 2016(1): 41-43.

[6] 仇书兴, 卢庆斌, 齐萌等. 河南省猪隐孢子虫感染调查[J]. 中国人兽共患病学报, 2008(5): 481-482.

[7] 陈甫. 微小隐孢子虫卵囊的形态结构与染色观察[J]. 中国病原生物学杂志, 2011(7): 511-512+556+566.

[8] Kennedy GA, Kreitner GL, Strafuss AC. Cryptosporidiosis in three pigs [J]. J Am Vet Med Assoc, 1977, 170: 348-350.

[9] Morgan UM, Xiao L, Monis P, et al. Molecular and phylogenetic analysis of Cryptosporidium muris from various hosts[J]. Parasitolo, 2000, 120: 457-464.

[10] 刘宇轩, 米荣升, 黄燕等. 基于微小隐孢子虫重组CP15/60蛋白的间接ELISA检测方法的建立及上海市猪隐孢子虫感染情况调查[J]. 中国动物传染病学报, 2015(4): 37-43.

[11] 陶立, 唐林生, 彭昊等. 广西融安某猪场感染隐孢子虫的情况调查[J]. 中国畜禽种业, 2012(9): 91-92.

[12] 李明峰. 猪隐孢子虫病调查报告[J]. 现代畜牧兽医, 2011(8): 38-40.

[13] 沈莉萍, 刘佩红, 薛霞等. 上海地区猪隐孢子虫感染状况调查[J].上海畜牧兽医通讯, 2009(2): 32-33.

[14] 仇书兴, 卢庆斌, 齐萌等. 河南省猪隐孢子虫感染调查[J]. 中国人兽共患病学报, 2008(5): 481-482.

[15] Quilez J, Sfinchez-Acedo C, Clavel A, et al. Prevalence of Cryptosporidium infections in pigs in Aragon(northeastern Spain)[J]. Vet Parasitol, 1996, 67: 83-88。

[16] Olsen ME, Thorlakson CL, Deselliers L, et al. Giardia and Cryptosporidium in Canadian farm animals[J]. Vet Parasitol, 1997, 68: 375-381.

[17] Xiao L, Fayer R, Ryan U, et al. Cryptosporidium Taxonomy: Recent Advances and Implicationsfor Public Health[J]. Clin Microbiol, 2004, 17: 72-97.

[18] Yu J, Seo M. Infection status of pigs with Cryptosporidium parvum[J]. Korean J Parasitol, 2004, 42: 45-47.

[19] 丁玲. 陕西省部分地区猪肠道寄生虫感染情况调查及猪源隐孢子虫种的鉴定[D]. 西安: 西北农林科技大学, 2015.

[20] Fu Chen, Kehe Huang. Prevalence and phylogenetic analysis of Cryptosporidium in pigs in eastern China[J]. Zoonoses and Public Health, 2007, 54: 393–400.

[21]谢小凡. 重庆市猪隐孢子虫病流行病学调查及虫种鉴定[J]. 兽医导刊, 2011(S1): 249-250.

[22] 陈兆国. 上海地区动物隐孢子虫病分子流行病学调查及微小隐孢子虫miRNA的初步鉴定[D]. 北京: 中国农业科学院, 2011.

S852.72+3

A

1007-1733(2017)07-0001-03

2017–03–17）

*通讯作者