马维文，张跃华，孙 红，王俊杰＊

（1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，呼和浩特 010019；2.内蒙古自治区草原工作站，内蒙古呼和浩特 010020）

白三叶新品系无菌苗培养及愈伤组织诱导

马维文1，张跃华1，孙 红2，王俊杰1＊

（1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，呼和浩特 010019；2.内蒙古自治区草原工作站，内蒙古呼和浩特 010020）

采用多因素区组试验方法，以白三叶新品系种子为材料对白三叶新品系无菌苗培养过程中消毒方法、培养基配方进行研究，以培育的无菌苗为材料对不同植物生长调节剂和不同外植体对白三叶新品系愈伤组织诱导的影响进行研究。结果表明：采用70%酒精消毒3min＋2%NaClO消毒10min，种子消毒效果最佳且对种子毒害作用最小，且在添加1.5%蔗糖的MS培养基上最适合无菌苗培养；白三叶新品系的茎较易脱分化，以茎为外植体进行愈伤组织培养，最佳培养基为MS＋2ug·L－16－BA＋3ug·L－12，4D，以叶为外植体进行愈伤组织培养，最佳培养基为MS＋0.5ug·L－16－BA＋1ug·L－12，4D。

白三叶新品系；无菌苗；愈伤组织

白三叶（Trifolium repens L.），属于豆科（Leguminosae）车轴草属（TrifoHum）植物，又名白花三叶草、白车轴草、白三草、车轴草、荷兰翅摇等。白车轴草，原产于欧洲，目前已在世界温带、亚热带地区非常广泛地种植。在我国云南、湖南、贵州内蒙古等地都有野生种分布。白三叶作为一种地被植物，不仅能够覆盖地面，而且具有有固氮、提高土壤氮素水平的能力。白三叶草适口性好，牛羊喜食，所含营养成分较高，且有助于动物消化，动物食用晒干物质后的消化率可达到80%，在饲用和经济方面具有较高价值和发展空间〔1〕。为选育适宜内蒙古种植的白三叶新品种，通过多年试验，建立了白三叶新品系。本试验以白三叶新品系为材料，进行了最优无菌苗的消毒方法和消毒剂筛选以及无菌苗培养基筛选研究，同时优化了白三叶无菌苗培养体系，以期为建立白三叶新品系组织培养再生体系、分子育种及抗病性研究等提供试验操作的基础依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究采用内蒙古农业大学草学系选育的白三叶（Trifolium repens L.）新品系的种子培育无菌苗。新品系植株特征：多年生草本茎匍匐，多节，无毛，主根较短，侧根和不定根生长茂盛，叶互生、三出复叶，小叶倒卵形至倒心形、抗寒性强。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗适宜消度方法的筛选

挑选成熟度好、大小均匀的白三叶新品系种子，砂纸打磨5～10min破除种子硬实，分成18组，每组50粒。消毒之前，用细纱布包裹种子，蒸馏水冲洗约20min后，用70%酒精分别浸泡1min、2min、3min，用无菌水冲洗5～6次，灭菌滤纸吸干种子表面残留液体。再分别用0.1%HgCl2和2%NaClO溶液浸泡白三叶种子2min、8min、12min；5min、10min、15min，期间要不断震荡，使其充分接触种皮表面。无菌水冲洗4～5次，无菌滤纸吸干种子表面。置于培养基中培养。共18个处理，每个处理5个重复，每个重复10粒种子。置于光照培养架上，统计发芽率、霉菌率。

表1 种子消毒步骤及水平设置

1.2.2 无菌苗的最适培养基筛选

在100mL三角瓶中加入不同成分培养基50mL左右，琼脂含量0.6%，pH5.8～6。以MS，1／2MS，1／4MS为基础培养基，添加0%、1.5%、3%蔗糖浓度，为筛选无菌苗最适宜的培养基，采用二因素随机区组实验，共计9个处理，8次重复，每次重复10粒。置于光照培养架上，统计发芽率、霉菌率。

1.2.3 不同培养基对无菌苗外植体茎、叶出愈率的影响

使用上述培养基培养出的无菌苗的根、茎、叶为外植体（生长30d），置于不同的培养基中，其中培养基中的6－BA浓度（0.5ug·L－1、1ug·L－1、2ug·L－1、3ug·L－1）2，4－D浓度（1ug·L－1、2ug·L－1、3ug·L－1、5ug·L－1），比较不同外植体的愈伤情况，统计出愈数。采用二因素随机区组实验，共计16个处理，6次重复，每次重复5粒。置于光照培养架上，统计出愈率。

1.2.4 数据计算和处理

采用EXCEL2007和SAS9.0进行数据处理和方差分析。相关指标的计算公式为：

发芽率（%）＝30天内正常发芽的种子粒数／供试种子粒数×100%

霉烂率（%）＝30天内霉烂种子粒数／供试种子粒数×100%

愈伤出愈率（%）＝30天内出愈块数／植入外植体总数×100%

2 结果分析

2.1 不同消毒方法对白三叶新品系种子萌发的影响

2.1.1 70%酒精和2%NaClO消毒对白三叶新品系种子萌发的影响

种子霉菌率和发芽率可以反映出消毒效果是否理想。两因素方差分析结果显示，70%酒精和2%NaClO不同消毒时间对白三叶新品系种子萌发具有显著影响作用（表2）。但是导致种子萌发率差异性的来源首先是70%酒精的消毒时间变化，其次是70%酒精和2%NaClO的共同作用，最后是2%NaClO消毒时间的变化。通过对9个处理组合进行方差分析，结果显示，K1、K3、K8处理下种子萌发率较高，且3个处理之间无显著性差异（P＞0.05），但是K1处理下种子发霉率最高达40%，K3和K8的发霉率均为0（表3）。因此白三叶新品系无菌苗培养中采用70%酒精消毒1min＋2%NaClO消毒15min或70%酒精消毒3min＋2%NaClO消毒10min效果较好。

表2 70%酒精和2%NaClO消毒时间对白三叶新品系种子萌发的影响

表3 70%酒精和2%NaClO消毒不同消毒时间对白三叶新品系种子萌发的影响

2.1.2 70%酒精和0.1%HgCl2对白三叶新品系种子萌发的影响

对白三叶种子用70%酒精和0.1%HgCl2进行消毒，9个处理下种子发霉率均为0。两因素方差分析结果显示，70%酒精和0.1%HgCl2不同消毒时间对白三叶新品系种子萌发具有显著影响作用（表4）。但是导致种子萌发率差异性的来源首先是70%酒精的消毒时间变化，其次是70%酒精和0.1%HgCl2的共同作用，最后是0.1%HgCl2消毒时间的变化。对9个处理组合进行方差分析，结果显示，L1、L4、L7、L9处理下种子萌发率较高，且4个处理之间在统计学上无显著性差异（P＞0.05），但是L9处理下种子萌发率最高达44%（表5）。

表4 70%酒精和0.1%HgCl2消毒时间对白三叶新品系种子萌发的影响

表5 70%酒精和0.1%HgCl2不同消毒时间对白三叶新品系种子萌发的影响

综合以上两种消毒方法，70%酒精＋0.1% HgCl2消毒法霉变率低，消毒效果较好，但是种子萌发率较低，70%酒精＋2%NaClO总体上种子萌发率和霉变率较高，但是采用70%酒精消毒1min＋2%NaClO消毒15min或70%酒精消毒3min＋2%NaClO消毒10min种子在不发霉的状况下，萌发率可达50%以上。

2.2 不同培养基成分对白三叶新品系无菌苗生长的影响

将白三叶种子培养在基本培养基（MS，1／2MS，1／4MS）和蔗糖浓度（0%、1.5%、3%）9种不同配比的培养基上，出苗率差异显著（P＜0.05）。两因素方差分析结果显示，不同培养基浓度和蔗糖浓度对白三叶新品系出苗具有显著影响作用（表6）。但是导致种子萌发率差异性的来源首先是蔗糖浓度变化，其次是基本培养基和蔗糖浓度的共同作用，最后是基本培养基浓度的变化。对9个处理组合进行方差分析，结果显示（表7），P2处理下出苗率最高且显著高于其他处理（P＜0.05），P3和P5培养基的出苗率次之，蔗糖浓度为0的培养基上白三叶新品系出苗率均最低，表明在培养基上添加适量浓度蔗糖利于植株生长。综上所述，白三叶新品系无菌苗培养最适培养基为MS＋1.5%蔗糖。

表6 不同培养基和蔗糖浓度对白三叶新品系出苗的影响

表7 不同培养基和蔗糖浓度下白三叶新品系出苗率情况

2.3 不同培养基对白三叶新品系外植体茎和叶出愈率的影响

适宜配比的细胞分裂素和生长素能够促进外植体脱分化形成愈伤组织，进而再次分化呈新植株。采用含有不同浓度的细胞分裂素6－BA和生长激素2，4－D对白三叶新品系的茎和叶进行愈伤组织培养。

两因素方差分析结果显示（表8），6－BA浓度和2，4－D浓度变化对白三叶新品系茎出愈率影响显著（P＜0.05）。出愈率的差异性首先来自于6－BA浓度变化，其次为6－BA和2，4D浓度的交互作用，2，4D浓度变化对差异贡献最小，2，4D对茎愈伤的影响较小。

表8 6－BA浓度和2，4－D浓度对白三叶新品系茎出愈率的影响

两因素方差分析结果显示（表8），6－BA浓度和2，4－D浓度变化对白三叶新品系叶的出愈率影响显著（P＜0.05）。出愈率的差异性首先来自于6－BA浓度变化，其次为6－BA和2，4D浓度的交互作用，最后为2，4D浓度变化，但2，4D浓度变化对叶愈伤的影响亦较大。

表9 6－BA浓度和2，4－D浓度对白三叶新品系叶出愈率的影响

对16种不同培养基配比下白三叶新品系茎和叶的出愈率进行方差分析（表10），白三叶新品系茎的愈伤能力整体高于叶的愈伤能力。C11培养基上茎的出愈率最高达到94.3%，显著高于其他处理（P＜0.05），C1、C4、C8次之，愈伤率在80%以上。C1培养基上叶的出愈率最高达90.0%，显著高于其他处理（P＜0.05），C7次之，愈伤率为53.3%以上，其他处理出愈率均较低。因此，白三叶新品系以茎为外植体进行愈伤组织培养，最佳培养基为MS＋2ug·L－16－BA＋3ug·L－12，4D；以叶为外植体进行愈伤组织培养，最佳培养基为MS＋0.5ug·L－16－BA＋1ug·L－12，4D。

表10 不同培养基无菌苗茎和叶片为外植体的出愈率

3 讨论与结论

3.1 消毒剂和消毒时间对种子萌发的影响

无论与NaClO还是HgCl2配合消毒，酒精消毒时间的变化都是导致白三叶新品系种子萌发率差异性的主要贡献因素，可见酒精的消毒作用占很大比重，但是单纯使用酒精并不能使种子完全达到无菌条件。有研究表明消毒剂在杀灭微生物的同时伤害外植体〔2〕。邢少辰等〔3〕研究表明，升汞和次氯酸纳处理使浸泡的栽培大豆（Glycine max）发芽率极低。使用2%NaClO溶液对白三叶新品系种子消毒不彻底，有霉菌现象出现，使用0.1% HgCl2虽能有效控制污染，但影响了白三叶新品系的发芽率，有的平均发芽率低至2%，可见HgCl2对白三叶种子造成的毒害作用较强。吴志刚等〔4〕发现单纯使用NaClO溶液处理番茄（Lycopersicon esculentum.）种子消毒不彻底，将近20%有污染，0.1%HgCl2虽然能有效控制污染，但毒害严重，仅有8%的种子发芽率，与本研究结果相似。NaClO消毒常用浓度2～5%，厚彦明等〔5〕用9%高浓度NaClO溶液中震荡25min，作为岷山红三叶种子的消毒方法，但未对其消毒效果进行评价。综合消毒效果及毒害效果，在培养白三叶新品系无菌苗过程中，采用70%酒精消毒3min后2%Na－ClO消毒10min进行种子消毒，效果最佳。

3.2 不同培养基和不同外植体类型对愈伤的影响

在不同6－BA浓度和2，4D浓度的培养基上，白三叶新品系茎的整体愈伤率较叶高，表明茎的分化程度较低，容易脱分化，愈伤能力较高。在茎的脱分化过程中6－BA的作用较大，2，4D主要起调节作用。在叶脱分化过程中6－BA和2，4D共同作用，因此二者的合理配比能够促进白三叶新品系叶脱分化形成愈伤组织。

〔1〕马毓泉.内蒙古植物志：第3卷〔M〕.呼和浩特：内蒙古人民出版社，1985.

〔2〕高雪芹，王俊杰，云锦凤，侯永霞，贾文秀.红三叶新品系无菌苗培养体系优化〔J〕.草地学报，2010，（06）：880－883＋896.

〔3〕邢少辰，林秀峰，庄炳昌.大豆无菌苗的获得〔J〕.吉林农业科学，2001，（02）：7－9.

〔4〕吴志刚，宋明，王志敏，牛义.番茄组织培养中无菌苗培养条件的优化〔J〕.中国农学通报，2006，（04）：335－337.

〔5〕厚彦明，师尚礼，杜文华，等.岷山红三叶愈伤组织诱导和植株再生研究〔J〕.草地学报，2008，16（4）：359－363.

［＊通讯作者］王俊杰，男，内蒙古呼和浩特人，教授，主要从事药用植物与牧草种质资源与育种研究，E－mail：jjw62＠163.com

Sterile Seedling Culture and Callus Induction of New Hybrid Trifolium repens L.

Ma Weiwen1，Zhang Yuehua1，Sun hong2，Wang Junjie1
（1.College of Grassland，Resources and Environment，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia Autonomous Region 010019，China；2.Inner Mongolia grassland workstation，Hohhot in Inner Mongolia010020，China）

With multifactor block test method，disinfection methods for seed，medium formula for sterile seedlings and callus of new hybrid Trifolium repens L.were researched，the results showed that using 70%alcoholfor 3minutes and 2%NaClO for 10minutes were the best seed disinfection method and had the least toxic to the seed.The most suitable medium for sterile seedling culture was MS supplemented with 1.5%sucrose.The stem of new hybrid Trifolium repens L.was more easier to be dedifferentiated，and the best callus induction medium for stem was MS＋2ug·L－16－BA＋3ug·L－12，4D，the best callus induction medium for leaf was MS＋0.5 ug·L－16－BA＋1ug·L－12，4D.

new hybrid Trifolium repens L.；sterile seedlings；callus

S336

A

2095—5952（2017）02—0043—06

2017－03－10

国家科技支撑计划课题（2012BAD13B07）；国家重点研发计划课题（2016YFC0500605）

马维文（1990－），女，河北张北县人，硕士研究生，主要从事牧草种质资源与育种研究，E－mail：mwxl90＠163.com。