陆新浩，刘 鸿，任祖伊

(浙江省余姚禽畜病防治研究所,浙江余姚 315400)

体外抗鸭坦布苏病毒的药物筛选试验

陆新浩，刘 鸿，任祖伊

(浙江省余姚禽畜病防治研究所,浙江余姚 315400)

为了探讨抗病毒药物对鸭坦布苏病毒的作用，选用5种常用的抗病毒药物(金刚乙胺、脱氧若卡素钠、病毒灵、利巴韦林、阿昔洛韦)进行体外抗鸭坦布苏病毒的药物筛选试验。结果表明，利巴韦林药物浓度为0.156 mg/mL～0.625 mg/mL时，在DF-1细胞中能抑制鸭坦布苏病毒的增殖、利巴韦林在体外对鸭坦布苏病毒具有抗病毒作用；而阿昔洛韦、金刚乙胺、脱氧若卡素钠、病毒灵等4种药物对鸭坦布苏病毒无明显抗病毒作用。

鸭坦布苏病毒；药物筛选；鸭

鸭坦布苏病毒是2010年4月在我国最早报道的一种新型病毒[1]，主要引起种(蛋)鸭产蛋性能急剧下降，一般产蛋率可由产蛋高峰的90%～95%迅速下降到5%～10%，甚至停产，可给养鸭业带来巨大经济损失[2]。病原学研究表明，该病毒为单股正链RNA病毒，系有囊膜的球形病毒粒子，大小约45～50nm，属于黄病毒科黄病毒属的一种新型病毒[3-4]。自2010年4月开始发现以后，半年内该病毒迅速传遍我国主要养鸭地区，鸭场一旦感染，鸭群几乎100%发病。该病毒传播极其迅速、感染力强，目前对其传播媒介、传播途径等流行病学情况尚未完全了解，也未见有效的商品化疫苗与抗体可防控该病[5-6]。

目前，因尚无有效防控鸭坦布苏病毒的高免血清和卵黄抗体，在治疗该病时，养殖户多使用广谱抗病毒药与复方抗病毒中草药进行治疗，同时使用抗生素防控细菌继发感染。为研究抗病毒药物对鸭坦布苏病毒是否具有有效的防控作用，笔者进行了体外抗鸭坦布苏病毒的药物筛选试验。

1 材料与方法

1.1 试验材料 鸭坦布苏病毒DF-1细胞适应株C01株[6]，DF-1细胞由浙江大学农业部动物疫病病原学与免疫控制重点开放实验室提供。DMEM培养液购自Invitrogen公司；胎牛血清购自PAA 公司；FITC 标记的羊抗鸡IgG 购自KPL 公司；脱脂奶购自上海光明乳业；分析纯甲醇液体和丙酮液体购自医药公司。DF-1细胞的生长液为加10%胎牛血清的DMEM，维持液为2%胎牛血清DMEM。

1.2 供试药物 利巴韦林注射液购自江苏某生物股份有限公司；阿昔洛韦片购自浙江某药业股份有限公司；金刚乙胺、脱氧若卡素钠、病毒灵(吗啉胍)由浙江义乌某动物药业有限公司提供。

1.3 试验方法

1.3.1 鸭坦布苏病毒TCID50测定 将生长旺盛的DF-1细胞消化后接种至96孔细胞培养板，置37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养。待DF-1细胞长成单层后，弃培养液，用PBS洗涤2次后加入用细胞维持液10倍系列稀释的病毒液，其稀释度分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6；0.1 mL/孔，4孔/每个稀释度，置培养箱中孵育1 h后弃病毒液，用PBS清洗2次后加入维持液。置培养箱中培养，4d后观察细胞病变，记录细胞病变数。按Reed-Muench方法计算病毒TCID50。

1.3.2 药物的细胞毒性测定 待DF-1细胞在96孔细胞培养板上长成单层后，弃培养液后，用PBS洗涤2次，将药物先用PBS稀释为5mg/mL，再用细胞维持液倍比稀释至21～25，将混有药物的维持液加入细胞培养板中，0.1 mL/孔，每个稀释度2孔，同时设无药物对照孔。每d观察2次，连续观察4 d。记录细胞病变情况，判定对细胞无毒性作用的药物浓度。

1.3.3 药物体外抗鸭坦布苏病毒试验 待DF-1细胞在96孔板上长成单层后，弃培养液，用PBS洗涤2次后，每孔接种100 TCID50的鸭坦布苏病毒液0.1 mL，37 ℃吸附1 h后弃病毒液，用PBS液洗涤2次，加入从最大无毒浓度开始用细胞维持液倍比稀释的药物，每种药物稀释为20、21、22、23、24、256种浓度梯度，0.1 mL/孔，每种稀释度重复4孔。同时设立正常细胞对照，100 TCID50病毒接种细胞对照。将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养，每d观察细胞病变，连续观察5 d，记录细胞病变情况。判定药物对病毒的作用。

1.3.4 间接免疫荧光抗体检测试验 按照1.3.3操作步骤获得的病毒感染细胞，加入含不同浓度利巴韦林的维持培养液，置37℃、5%CO2培养箱中培养48 h,倾弃96孔板中培养基，用PBS清洗2次，每孔加甲醇丙酮等体积混合液150 μL，置-20 ℃冰箱固定20min。倾弃固定液，风机风干， 每孔用200 μL 5%脱脂奶37℃摇床封闭1 h；PBS清洗2次后，加用5%脱脂奶1∶200稀释鸡血清，37℃摇床反应2 h；PBS清洗3次，每孔加5%脱脂奶1∶200稀释的FITC 羊抗鸡IgG 100 μL，37℃摇床反应1 h；PBS清洗5次，加50 μL PBS，在荧光显微镜下观察结果。

2 结果与分析

2.1 TCID50测定结果 按Reed-Muench方法计算鸭坦布苏病毒C01株第7代的TCID50为10-3.3/0.1 mL。

2.2 药物的细胞毒性测定结果 详见表1。

表1 5种药物的细胞毒性测定

注：细胞75%以上病变记为+++， 50%病变记为++，25%病变记为+，无病变记为-。

由表1可见，将不同稀释度的药物加于细胞维持培养液中与细胞一起培养，连续观察4 d，记录细胞病变情况，5种药物的最大无毒浓度分别为：阿昔洛韦0.625 mg/mL，利巴韦林0.625 mg/mL，病毒灵0.625 mg/mL，脱氧卡若素钠0.312 mg/mL，金刚乙胺0.078 mg/mL。

2.3 药物体外抗病毒试验结果 详见表2。

表2 体外抗病毒试验

注：细胞病变记为++，无病变记为-。

由表2可见，鸭坦布苏病毒感染DF-1细胞后加入含不同浓度抗病毒药的维持培养基，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每d观察细胞病变情况，5 d后判断结果。利巴韦林浓度为0.625 mg/mL～0.156 mg/mL时，细胞未出现病变，与未接毒的细胞对照基本一致(详见图1)，加有阿昔洛韦、金刚乙胺、脱氧若卡素钠、病毒灵的细胞与病毒对照则无明显差异，细胞圆缩、融合、脱落。结果表明，利巴韦林浓度为0.156 mg/mL～0.625 mg/mL时，在DF-1细胞上对鸭坦布苏病毒具抑制病毒生长的作用，而阿昔洛韦、金刚乙胺、脱氧若卡素钠、病毒灵对鸭坦布苏病毒无明显抗病毒作用。

2.4 间接免疫荧光抗体检测试验结果 详见图2。

图1 1利巴韦林处理的感染细胞，2病毒感染的细胞，3 未感染的正常细胞

A：病毒感染后用正常维持培养基培养48 h后；B：病毒感染后用浓度为0.156 mg/mL利巴韦林的维持培养基培养48 h后；C：未感染的正常细胞。图2 间接免疫荧光检测利巴韦林处理的细胞

由图2可见，将含不同浓度利巴韦林的维持液与鸭坦布苏病毒感染的DF-1细胞一起培养48 h后进行间接荧光抗体检测，在荧光显微镜下可见鸭坦布苏病毒感染的细胞发出很强的绿色荧光，而在不同浓度利巴韦林培养基中的感染细胞和正常对照细胞基本未见荧光，其中利巴韦林的最小有效浓度为0.156 mg/mL。结果表明，利巴韦林能有效抑制鸭坦布苏病毒在细胞中增殖。

4 小结与讨论

鸭坦布苏病毒是引起种(蛋)鸭产蛋量迅速下降的一种新型病毒，对该病目前尚无有效的防控措施。为探讨5种常用抗病毒药物对鸭坦布苏病毒的防控作用，笔者通过体外抗病毒试验，研究了金刚乙胺、脱氧若卡素钠、病毒灵、利巴韦林、阿昔洛韦等5种药物对鸭坦布苏病毒的抗病毒作用。结果表明，利巴韦林能有效抑制鸭坦布苏病毒引起的细胞病变。为了进一步验证结果的可靠性，笔者进行了间接免疫荧光检测，在荧光显微镜下明显可见鸭坦布苏病毒感染的细胞中含有大量病毒抗原蛋白，而与利巴韦林相互作用的细胞中病毒抗原蛋白表达量很小，利巴韦林确能有效抑制鸭坦布苏病毒在细胞中增殖。

利巴韦林(Ribavirin)又名病毒唑，是一种广谱抗病毒药物，对多种DNA和RNA病毒均有抗病毒作用，通过与RNA聚合酶作用而抑制病毒复制[7]。曾有体外研究报道表明，利巴韦林对黄病毒属的日本乙型脑炎病毒、登革热病毒、黄热病毒及西尼罗病毒具有良好的抗病毒作用[8-10]。也有动物实验研究表明，利巴韦林对沙粒病毒和裂谷热病毒感染的小鼠、裂谷热病毒感染的恒河猴、汉坦病毒感染的乳鼠体内具有高度的抗病毒作用[11]。利巴韦林在体内对鸭坦布苏病毒是否具有抗病毒活性还需作进一步的体内抗病毒研究试验。

另外，笔者的试验结果表明病毒灵、金刚乙胺、脱氧若卡素钠、阿昔洛韦等4种药物对鸭坦布苏病毒没有抗病毒活性。

据此，笔者建议广大养殖户及临床兽医在治疗鸭坦布苏病毒病时，不宜使用病毒灵、金刚乙胺、脱氧若卡素钠、阿昔洛韦这类抗病毒药物进行治疗，以免造成抗病毒药物的滥用而又达不到治疗效果。

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农业部要求大力推进畜牧业供给侧结构性改革，推动畜牧业转型升级，加快建设现代畜牧业

最近，2017年全国农牧渔业大县局长轮训第2期培训班，生猪调出大县畜牧局长班在北京举办。农业部领导在开班式上强调，要深刻认识农业供给侧结构性改革的重大意义，准确把握农业供给侧结构性改革目标任务，以大力推进畜牧业供给侧结构性改革为主线，以绿色发展为导向，以结构调整为重点，培育发展新动能，协调推进保供给、保安全、保生态各项工作，推动畜牧业转型升级，加快建设现代畜牧业。

农业部领导指出，2017年是全面落实“十三五”规划的关键一年，也是推进畜牧业发展结构调整、转型升级的关键一年。推进畜牧业供给侧结构性改革，要突出抓好九方面工作：一是加大粮改饲试点力度，调整优化生猪区域布局，大力发展现代草牧业，做大做强优势特色畜牧业，推进结构调整。二是抓好畜禽粪污处理和资源化利用，深入开展畜牧业绿色发展示范县创建，积极推广种养结合循环发展模式，持续加强草原生态保护建设，推进绿色发展。三是进一步研究落实草原改革任务，健全完善以绿色生态为导向的政策支持体系，加强畜牧业法制建设，加强政风行风建设，推进支撑保障体系建设。四是大力发展畜禽标准化规模养殖，加快奶业振兴发展，促进饲料工业转型发展，建设现代畜禽牧草种业，强化产业科技创新推广，推动一二三产融合发展，提升产业竞争力。五是强化饲料质量安全监管，加强饲料质量安全风险监测，严格生鲜乳质量安全监管，全面推进安全生产，提升质量安全水平。六是加强产业监测预警，建立健全草原管理数据体系，加强行业数据管理和共享，加强产业发展跟踪研究，提升行业精准管理水平。七是坚决不放松对高致病性禽流感等重大动物疫病的防控，强化动物防疫监督执法，维护养殖业安全。八是加大对人畜共患病防控力度，维护公共卫生安全。九是重视做好动物源性食品安全保障工作，维护食品安全。

农业部领导强调，加快推进畜禽养殖废弃物资源化处理，是当前推进畜牧业供给侧结构性改革和畜牧业绿色发展的一项要务。要总结经验，明确目标，突出重点，切实贯彻绿色发展新理念，加快补齐现代畜牧业发展的环境短板，推动现代种业结合农牧循环发展，推进粮饲兼顾、农牧结合、循环发展的新型种养结构。

《浙牧》讯

2017-03-17

陆新浩，E-mail：yylxh68@126.com

S858.32

A

1005-7307(2017)04-0005-004