杨彪，郭杰，肖纯凌*

（1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳110847；2.沈阳医学院，辽宁省环境污染与微生态重点实验室）

PM2.5暴露对CB17-SCID荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞活力的影响

杨彪1，郭杰2，肖纯凌2*

（1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳110847；2.沈阳医学院，辽宁省环境污染与微生态重点实验室）

目的：探讨PM2.5暴露对CB17-SCID荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞活力的影响。方法：制作CB17-SCID荷瘤小鼠模型；应用冷光源内窥镜和电泳点样吸头完成对CB17-SCID荷瘤小鼠的PM2.5暴露和生理盐水暴露；采用BCA法检测支气管肺泡灌洗液中总蛋白水平，细胞活力实验检测肺泡巨噬细胞的增殖能力，中性红实验检测肺泡巨噬细胞吞噬功能。结果：PM2.5暴露组支气管肺泡灌洗液中总蛋白水平、肺泡巨噬细胞增殖能力及吞噬功能均明显高于生理盐水暴露组（P＜0.01）。结论：PM2.5暴露处理CB17-SCID荷瘤小鼠，激活肺泡巨噬细胞清除PM2.5的功能，同时刺激呼吸系统分泌机体蛋白。

空气细颗粒物；支气管肺泡灌洗液；肺泡巨噬细胞；细胞活力实验；中性红实验；CB17-SCID荷瘤小鼠

近年，空气污染物尤其是PM2.5暴露已经成为危害人类健康的重要问题，PM2.5暴露会导致肺功能的降低及肺实质的损伤。流行病学研究表明，环境中PM2.5的含量不断提高，会增加肺癌等呼吸系统疾病和心血管系统疾病的入院率和死亡率[1]。肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AMs）广泛分布于呼吸道肺泡表面，作为肺部主要的免疫防御细胞，当有刺激因子作用时，即在机体需要加强炎症反应时，分泌促进炎症或放大炎症的介质，而在炎症反应过于强烈时，分泌抑制炎症的介质[2]。AMs在各个阶段释放的细胞因子水平与机体所处的状态相协调，以便能发挥其免疫防御的功能。同时，AMs也具有很强的弹性蛋白酶分泌能力，这使得周围组织更容易受到酶的作用，最终破坏肺组织结构[3]。通过支气管肺泡灌洗液（BALF）采集支气管及肺泡内液的标本，能有效地反映肺内病变指标及防御能力的改变情况。前期研究通过应用冷光源内窥镜和电泳点样吸头对小鼠进行气管滴注完成对PM2.5暴露CB17-SCID荷瘤小鼠的研究[4]，综合分析PM2.5暴露作为诱导因素处理对AMs及机体的影响。本研究拟通过体内实验进一步了解PM2.5暴露影响肿瘤细胞发展的相关机制，明确PM2.5调节肺癌发展的新方向。

1 材料与方法

1.1 材料实验动物：20只清洁级雄性CB17-SCID小鼠（体重22～24 g，许可证号：SCXK（京）2012-0001）购于北京维通利华实验动物技术有限公司，常规饲养于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级动物房内，12 h/12 h昼夜光照，温度为22～24℃，湿度为70%。实验用CB17-SCID小鼠使用符合动物福利和伦理要求，实验方案获学校伦理委员会批准。

主要材料与仪器：本研究PM2.5浓度的设计既考虑了人和动物种属间的差异（约10倍），也考虑了动物实验结果外推于人的安全性（约10倍），因此PM2.5暴露浓度相当于国家《环境空气质量标准》（GB3095-2012）二级日标准的100倍。应用于本研究的PM2.5悬液浓度20 mg/ml，PM2.5样品为实验室保存，主要成分及特点分析参考文献[5]。CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit（美国Promega公司）；BCA protein assay kit（美国Thermo公司）；中性红染料（美国Amresco公司）；台盼蓝染色液（0.4%，北京索莱宝科技有限公司）；冷光源硬性内窥镜（徐州科能光电设备有限公司）；A549细胞株（实验室保存）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；RPMI-1640完全培养基、胰蛋白酶-EDTA消化液（美国Gibco公司）；青霉素-链霉素溶液、磷酸盐缓冲液（PBS）（美国Hyclone公司）。96孔细胞培养板、100 mm细胞培养皿、15和50 ml离心管（美国康宁公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 荷瘤小鼠模型制作及分组将A549细胞株置于RPMI-1640完全培养基在37℃和5%CO2条件下培养。RPMI-1640培养基中加入10%的胎牛血清，100 U/ml的青霉素和100µg/ml的链霉素。取对数增长期A549细胞，0.4%台盼蓝染液染色，显微镜下进行活细胞计数，确保细胞活性大于95%，用生理盐水调整浓度至2.5×106个/ml，进行小鼠尾静脉注射。每只小鼠尾静脉注射A549细胞5×105个。采用随机数字表法将小鼠分为2组，PM2.5暴露组和生理盐水暴露组，各10只。

1.2.2 气管滴注处理CB17-SCID荷瘤小鼠模型制作完成6周后进行气管滴注操作。实验组气管滴注PM2.5悬液（20 mg/ml），对照组气管滴注生理盐水，均20 μl/次，2次/周，共4周。

1.2.3 BALF收集及AMs分离、培养使用摘眼球法采集小鼠外周血后，将CB17-SCID荷瘤小鼠处死，固定后喷洒适量75%乙醇，在无菌条件下进行支气管肺泡灌洗术：收集约5 ml肺泡灌洗液，并转移至15 ml离心管中；（2）4℃条件下以1 000 r/min，离心10 min，收集上清液备用。（3）用PBS缓冲液悬浮细胞后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基悬浮细胞。（4）经过培养后，取贴壁生长的AMs进行下一步的实验研究。

1.2.4 BALF中总蛋白含量检测采用BCA法检测BALF中总蛋白水平。将试剂盒的A溶液与B溶液按照50︰1的比例混合，混匀后，加入96孔板，每孔加入200 μl混合液，同时每孔加入PM2.5暴露组或生理盐水暴露组的BALF待检样品20 μl。37℃孵育30 min后，在532 nm波长下检测吸光度值。标准曲线按照试剂盒说明书完成。

1.2.5 细胞计数及图像采集通过血细胞计数板对收集得到的灌洗细胞进行计数，同时使用Leica AM6000显微镜对接种在培养板中的细胞进行图像采集。

1.2.6 细胞活力检测将肺泡灌洗得到的细胞悬液直接加入到96孔板中，每孔100 μl，分别培养24 h和48 h，按照下述方法完成细胞活力检测。读取吸光度值前向待检孔中加入20 μl的CellTiter 96®AQueous One Solution Reagent；置于37℃细胞培养箱中孵育1～4 h。在490 nm波长下检测吸光度值。

1.2.7 中性红实验将肺泡灌洗得到的细胞悬液计数后，等量加入到96孔板中，培养12 h弃上清。每孔加入0.1%中性红溶液100 μl，继续于培养箱中孵育；3 h后取出细胞板，弃上清并用生理盐水洗5遍；每孔加入细胞裂解液（醋酸与无水乙醇等体积混合）50 μl，振荡10 min后；在520 nm波长下检测吸光度值。

1.3 统计学方法采用GraphPad PRISM 5.0 software进行统计学分析。所有实验至少重复3次。结果比较采用非配对双侧t检验及ANOVA，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BALF中总蛋白水平比较BCA检测结果显示，PM2.5暴露组收集得到的BALF中总蛋白水平（0.4513± 0.0175）明显高于生理盐水暴露组（0.3809±0.0236）（P＜0.01）。

2.2 AMs数量比较及图像采集通过血细胞计数板对BALF中收集得到的细胞进行计数发现，PM2.5暴露组细胞总数为（536 700±24 040）个，高于生理盐水暴露组的（336 700±23 330）个（P＜0.01）。

通过Leica AM6000显微镜对接种培养板中的细胞进行图像采集发现，贴壁生长的细胞形态规则统一，能够确定从CB17-SCID荷瘤小鼠BALF中离心收集得到的细胞主要为AMs，见图1。

图1 AMs形态学观察（×100）

2.3 AMs活力比较细胞活力检测实验发现，PM2.5暴露组收集到得AMs经过24 h和48 h的增殖细胞数检测证实增殖能力显著提高，且差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图2 AMs活力比较

2.4 AMs吞噬功能比较中性红实验结果发现，PM2.5暴露组AMs的吞噬能力（0.2547±0.0083）强于生理盐水暴露组（0.1860±0.0112）（P＜0.01）。

3 讨论

空气颗粒物与肺实质间的作用与颗粒物的特征有关，如颗粒物的表面积、组分和其吞噬作用等。流行病学调查和实验研究已经证实空气污染会导致呼吸系统疾病发生率及肺功能损伤的增加，会增加当地的入院率并且带来诸多对健康不利的后果，包括哮喘[6]、慢性阻塞性肺疾病[7]、呼吸系统感染[8]、肺癌[9]。

本研究发现PM2.5暴露组能够刺激AMs活力，包括增殖能力和吞噬功能的增强，同时显著提高BALF中蛋白表达水平，说明机体启动应激反应，PM2.5暴露组小鼠气道阻力增加明显，同时BALF中的蛋白水平可以直接反映炎症效应，可以调节肺部的炎症反应[10-11]，而这些机体生理功能的改变都为PM2.5暴露对CB17-SCID荷瘤小鼠AMs的研究产生重要意义，而且相对于体外暴露实验[12-13]，本研究完成的体内实验更能说明AMs在体内受到外界因子刺激后的生理特点。

AMs存在于肺泡和支气管表面，既是防御外来有害因子的生物屏障，又是清除有害因子的靶细胞。BALF中炎症细胞计数是反映气道炎症的一个重要指标，本研究发现PM2.5暴露组小鼠BALF中AMs增加明显，说明暴露可致肺局部炎症细胞的聚集，而气管滴注颗粒物能导致肺功能降低并产生炎症反应，为了清除进入机体的PM2.5刺激因子，继而活化释放一系列炎症因子、趋化因子、氧自由基与蛋白酶等，AMs参与一系列病理生理过程[14-15]。中性红实验同样说明PM2.5的刺激作用使得一部分AMs的吞噬能力增强。PM2.5能够影响AMs的氧化应激性，即能够使细胞内高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基产生过多，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤[16]。AMs活力增强，表达功能性蛋白的能力相应提高，刺激机体产生更为强烈的炎症反应，为肿瘤转移提供了适宜的微环境。

研究说明，当人体长时间暴露在PM2.5的环境下，AMs释放大量细胞因子，颗粒物可以引发人类气道的炎症反应，从而引起或加重各种呼吸道疾病，严重影响呼吸系统功能，最终增加呼吸系统疾病的发生率和死亡率。研究还需进行AMs和肿瘤细胞的共培养方法及PM2.5暴露处理实验，进一步研究PM2.5对机体产生的影响。对空气颗粒物的研究不仅可以为某些疾病的预防奠定基础，并能为更好地阐述受到空气污染后相关疾病的致病机制，为有可能通过发现新的分子作用通路，更加明确其细胞途径和科学的解释。

（致谢：感谢辽宁中医药大学实验动物中心在实验动物饲养及实验过程中给予的帮助。）

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Effects of PM2.5Exposure on Viability of Alveolar Macrophages of Tumor-bearing CB17-SCID Mice

YANG Biao1，GUO Jie2，XIAO Chunling2*
（1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；2.Shenyang Medical College，Key Lab of Environmental Pollution and Microecology of Liaoning Province）

Objective：To investigate the effects of PM2.5exposure on viability of alveolar macrophages（AMs）of tumor-bearing CB17-SCID mice.Methods:The models of tumor-bearing CB17-SCID mice were made.The cold light source endoscope and micro pipette tips completed the PM2.5exposure and normal saline（NS）exposure.The levels of protein in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were determined by BCA assay.The proliferation of AMs was determined by viability assay.The phagocytosis ability of AMs was detected by neutral red assay.Results:Comparing NS exposure，PM2.5exposure could increase the levels of total protein in BALF，enhance the viability and phagocytosis of AMs（P＜0.01）.Conclusion：To adapt to the environment change（PM2.5exposure），AMs enhance the ability of removing PM2.5，and stimulate the secretion of proteins by respiratory system in tumorbearing CB17-SCID mice.

PM2.5；bronchoalveolar lavage fluid；alveolar macrophage；viability assay；neutral red assay；tumor-bearing CB17-SCID mice

R994.6

A

1008-2344（2017）02-0087-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.02.005

2016-12-01

（文敏编辑）

沈阳市环境污染与重点实验室建设（No.F14-181-1-00）

杨彪（1984—），男（汉），2014级博士研究生，研究方向：环境污染物对呼吸系统影响研究.

肖纯凌（1964—），女（汉），教授，博士生导师，研究方向：大气污染对呼吸道的影响机制及微生态研究.E-mail: xiaochunling@symc.edu.cn