张梦月，孙燕，于宁，李欣楠，马积昊，杨晓竹

（1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业2012级，辽宁沈阳110034；2.物理学教研室；3.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心；4.辽宁何氏医学院2011级临床医学专业）

黄连解毒汤对S180肉瘤、M VD及VEG F、M M P-9表达的影响

张梦月1，孙燕2*，于宁1，李欣楠3，马积昊4，杨晓竹1

（1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业2012级，辽宁沈阳110034；2.物理学教研室；3.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心；4.辽宁何氏医学院2011级临床医学专业）

目的：研究黄连解毒汤对肿瘤生长的抑制作用及其对肿瘤组织血管生长相关因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达及微血管密度（MVD）的影响。方法：将50只健康雌性小鼠随机分为生理盐水对照组，环磷酰胺组，黄连解毒汤大、中、小剂量组。建立小鼠S180肉瘤模型，对照组灌胃20 ml/kg生理盐水，环磷酰胺组灌胃25 mg/kg环磷酰胺；黄连解毒汤大、中、小剂量组分别灌胃22.0、11.0、5.5 g/kg黄连解毒汤，观察抑瘤率，并采用免疫组化的方法研究黄连解毒汤对肿瘤组织VEGF、MVD、MMP-9的作用。结果：黄连解毒汤大剂量组对小鼠S180肉瘤具有明显的抑制作用，免疫组化染色显示黄连解毒汤可明显下调VEGF、MMP-9的表达，同时对肿瘤组织的MVD有明显抑制作用。结论：黄连解毒汤可通过抑制VEGF及MMP-9的表达来抑制血管的生成从而抑制肿瘤的生长。

黄连解毒汤；S180肉瘤；血管内皮生长因子；微血管密度；基质金属蛋白酶-9

黄连解毒汤出自《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏和栀子组成，是清热解毒代表方剂。该方具有明显抑制恶性肿瘤的作用［1］。但黄连解毒汤抗肿瘤作用机制研究较少，现有研究主要集中在其影响细胞增殖能力及诱导细胞凋亡等方面［2-3］。亦有研究表明黄连解毒汤能增强荷瘤小鼠体内NK细胞的杀伤功能及体液免疫功能［4］。在前期研究中发现，黄连解毒汤抗肿瘤作用可能与抗肿瘤血管生成有关［5］。在此基础上我们采用S180移植性肿瘤模型，观察了黄连解毒汤对S180的抑制作用，同时观察了其对肿瘤组织内血管内皮生长因子（VEGF）、微血管密度（MVD）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达情况，进一步探讨黄连解毒汤抑瘤作用与血管生成的关系，为其抗肿瘤机制研究提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物黄连解毒汤：黄连、黄芩、黄柏，栀子均购于沈阳市药材公司，经沈阳药科大学中药鉴定教研室专家鉴定为正品；阳性对照药环磷酰胺，通化茂祥制药有限公司出品，批号120301；VEGF一抗，Santa Cruz产品；鼠抗人CD34单克隆抗体、超敏S-P（鼠/兔）试剂盒、MMP-9一抗、DAB显色试剂盒均为武汉博士德生物工程有限公司产品。

1.1.2 动物与瘤株健康雌性昆明种小鼠，体重18～22 g，由沈阳药科大学实验动物中心提供，动物合格证号：辽实动字（2000）第042号。腹水型S180瘤株购自于吉林省肿瘤研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 黄连解毒汤药液制备黄连、黄芩、黄柏、栀子按原方重量比（3∶2∶2∶3）煎煮2次，分别加10倍、8倍的水煎煮60、40 min，合并煎煮液，浓缩至含生药1.4 g/ml，置4℃冰箱保存备用。1.2.2动物分组将50只健康雌性昆明种小鼠随机分为5组，每组10只。分别为对照组，灌胃生理盐水，用量20 ml/kg；环磷酰胺组，用量25 mg/ kg；黄连解毒汤大、中、小剂量组，22.0、11.0、5.5 g/kg。黄连解毒汤大、中、小剂量组分别相当于60 kg成人日用量的4、2、1倍。

1.2.3 瘤株移植方法及给药S180腹水瘤细胞株经昆明种小白鼠腹腔移植传代，取传代7 d的小鼠，无菌操作，从腹腔抽取腹水瘤细胞液，用生理盐水调至1×107个/ml，每鼠于右前腋下接种0.2 ml。接种次日开始给药，每日1次，CTX组小鼠体重减轻后改为隔日给药，用药7 d。

1.2.4 肿瘤组织免疫组化染色用药后7 d各组小鼠均于末次给药后1 h进行以下实验：称重后，脱颈处死小鼠，剥离肿瘤组织，精密电子天平称重。新鲜的肿瘤组织做冰冻切片，厚8µm，用于VEGF、MVD、MMP-9免疫组化，步骤按说明书进行，VEGF、MVD、MMP-9一抗均为1∶100稀释。

1.3 观察指标及观察方法

1.3.1 抑瘤率抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。

1.3.2 肿瘤组织VEGF、MVD、MMP-9免疫组化测定VEGF免疫组化染色评分标准按Rahman等方法［6］进行，即染色评分=着色细胞的比例评分（染色范围）+染色的强度评分。染色范围（阳性细胞比率）分为0～4级：0分，阴性；1分，阳性细胞1%～25%；2分，阳性细胞26%～50%；3分，阳性细胞51%～75%；4分，阳性细胞76%～100%。染色强度标准划分为0～3级：0分，阴性；1分，弱阳性；2分，中等强度；3分，强阳性。

MVD的测定（CD34阳性判断标准）按何振辉［7］的方法，凡是染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为1个血管计数，凡管腔有较厚肌层包绕或管腔内红细胞＞8个的血管区域不予计数。计数方法：先于100倍视野内选取3个血管高密度的区域，再转到200倍视野计数每个区域的血管数量，取3个数值的平均值作为微血管密度。

MMP-9检测参照陈雷等［8］的方法给予评分，将切片置于载物台上，随机选取5个高倍镜视野（物镜40×），根据细胞膜或浆的染色程度及染色细胞的百分比分析评分，即评分标准是：最后得分=每张切片着色度得分×着色细胞百分比得分。着色度得分：基本不着色为0分；着色淡为1分；着色适中为2分；着色较深为3分。着色细胞百分比得分：着色细胞占计数细胞的百分率≤5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；≥51%为3分；最后总分得0～1分，评为阴性（－）；2～3分，评为弱阳性（+）；4～5分，评为中阳性（++）；≥6分，评为强阳性（+++）。

1.4 统计学方法应用SPSS 19.0软件，所有计量资料采用（x±s）表示，采用方差分析进行显著性检验；两等级资料比较用Mann－Whitney-U秩和检验；计数资料采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄连解毒汤对S180荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响S180荷瘤小鼠经药物处理7 d后，取肿瘤组织称重，结果表明，CTX组和黄连解毒汤各剂量组小鼠的瘤重均小于对照组。其中，CTX组与黄连解毒汤大剂量组对小鼠S180肉瘤瘤重具有明显的抑制作用（P＜0.01，P＜0.05）。且与CTX组相比，黄连解毒汤大、中剂量组小鼠饮食、毛色、精神状况明显较优，见表1。

表1 黄连解毒汤对S180荷瘤小鼠实体瘤的抑制作用（x±s，n=10）

2.2 黄连解毒汤对S180肿瘤组织中VEGF表达的影响免疫组织化学染色结果显示，VEGF主要定位于S180肿瘤细胞的细胞质，且在S180肿瘤组织中呈高表达，见图1。与对照组比较，CTX对VEGF表达无显著影响，而黄连解毒汤小剂量组有下调VEGF表达的趋势，但未达到显著水平，差异无统计学意义（P＞0.05），大、中剂量组对VEGF表达有明显的抑制作用，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表2。

2.3 黄连解毒汤对S180肿瘤组织中MVD的影响免疫组化染色后，镜下观察血管内皮细胞呈棕色，对照组可见微血管广泛分布于组织间质内，与对照组比较，CTX组与黄连解毒汤各剂量组MVD均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）。见表2和图2。

表2 黄连解毒汤对S180肉瘤VEGF表达和MVD的影响（x±s，n=10）

图2 免疫组化染色检测MVD（×200）

2.4 黄连解毒汤对S180肿瘤组织中MMP-9表达的影响免疫组织化学染色显示，MMP-9主要定位于S180肿瘤细胞的细胞质，细胞膜也可见染色，呈棕黄色，且在S180肿瘤组织中呈高表达。与对照组相比，黄连解毒汤中、大剂量组阳性表达率差异有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）；Mann-Whitney-U秩和检验同样显示，黄连解毒汤可使MMP-9表达显著下调。结果见表3和图3。

3 讨论

肿瘤生长过程中需要丰富的血供，这就要求大量肿瘤血管新生。肿瘤血管生成是一个多阶段的复杂过程，是肿瘤生长和转移的基础，抗肿瘤血管生成就是针对肿瘤血管生成过程中某些因子及其关键步骤进行抑制和干扰，从而减少或抑制肿瘤的血管生成。血管新生在体内受一系列因子调节，其中以VEGF最为重要，它是维持血管功能和肿瘤扩增的关键因子，可以诱导内皮细胞增殖、迁移甚至改变其基因表达，还能增加微血管的通透性。VEGF可能在多种血管生长因子中起到中心调控作用［9］，并已成为抗肿瘤血管生成治疗的靶点［10］。本研究中，CTX对VEGF的表达无显著作用，可能是剂量原因。而黄连解毒汤大、中剂量组对VEGF的表达有明显的抑制作用，说明抗血管生成可能是黄连解毒汤抗肿瘤作用的重要机制。

表3 黄连解毒汤对S180肉瘤MMP-9表达的影响（x±s，n=10）

图3 免疫组化染色检测MMP-9的表现（×400）

MVD能较为准确地反映肿瘤内的血管状态，是一种反映肿瘤血管形成程度的量化指标，目前MVD已被公认为是预测肿瘤预后一个独立指标，它与肿瘤的侵袭性密切相关［11］。本研究发现黄连解毒汤各剂量组均有明显抑制MVD作用，提示黄连解毒汤可通过降低MVD来发挥抑瘤作用。

基质金属蛋白酶家族（MMPs）是一大类锌依赖性内肽酶家族，能降解一种或几种细胞外基质，参与结缔组织的降解和重建、炎症反应、肿瘤的扩散转移以及缺血缺氧损伤等。研究表明MMPs在肿瘤的浸润和转移中起着重要作用［12］。其中MMP-9被认为是与肿瘤的转移和侵袭性关系最密切的金属蛋白酶［13-14］。本研究表明，黄连解毒汤对MMP-9的表达具有明显的抑制作用。

本研究发现，黄连解毒汤大、中、小剂量组小鼠的瘤重均小于对照组，其中黄连解毒汤大剂量组对小鼠S180肉瘤具有明显的抑制作用。虽然其对S180肿瘤的抑瘤率不及CTX强，但与CTX组相比，黄连解毒汤大、中剂量组小鼠饮食、毛色、精神状况明显优于CTX组，说明黄连解毒汤在抑制肿瘤的同时，可提高小鼠的生存质量。

综上所述，黄连解毒汤可能通过降低肿瘤组织中的MVD，并下调VEGF及MMP-9的表达水平来抑制肿瘤血管生成。

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In h i b i t o r yEf f e c t s o f H u a n g l i a n j i e d uD e c o c t i o no nS180Sa r c o ma,M VD a n dt h e Ex p r e s s i o no f VEG F a n d M M P-9

ZHANG Mengyue1，SUN Yan2*，YU Ning1，LI Xinnan3，MA Jihao4，YANG Xiaozhu1
（1.Grade 2012，Shenyang Medical College,Shenyang 110034，China；2.Department of Pharmacology；3.Liaoning Province Animal Feed Quality and Safety of Veterinary Testing Centers；4.Grade 2011,He University）

O b j e c t i v e：To study the antitumor activity of Huanglianjiedu Decoction in vivo and the inhibitory effects on microvessel density（MVD）and the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and matrix metalloproteinase-9（MMP-9）.Methods：A total of 50 healthy female Kunming mice（18-22 g）were randomly divided into 5 equal groups：control group，CTX positive group and Huanglianjiedu Decoction high，medium and low dose groups.S180tumor-bearing mice-model was established by the inoculation of 0.2 ml S180cell suspension subcutaneously.The control group was gavaged by normal saline,the CTX positive group was gavaged by CTX at a dose of 25 mg/kg，the high，medium and low dose Huanglianjiedu Decoction group was gavaged by Huanglianjiedu Decoction at a dose of 22，11，5.5 g/kg.Immunohistochemical method was performed to detect MVD and the expression of VEGF and MMP-9.Results：Compared with the control group，high dose Huanglianjiedu Decoction group significantly inhibited tumor growth with the rate up to 41.69%，which was similar to CTX positive group.The expression of VEGF and MMP-9 were also inhibited by Huanglianjiedu Decoction.And MVD were also markedly reduced after Huanglianjiedu Decoction treatment.Conclusion：One of the antitumor mechanisms of Huanglianjiedu Decoction may be the angiogenesis inhibitory activity by inhibiting the expression of VEGF and MMP-9.

Huanglianjiedu Decoction；S180sarcoma；VEGF；MVD；MMP-9

R285

A

1008-2344（2017）02-0178-04

2016-01-28

（吴迪编辑）

沈阳医学院科技基金项目（No.20151020）

孙燕（1979—），女（汉），博士，讲师，研究方向：中药药理学.E-mail：inksun@163.com

d o i：10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.02.032