葛 娜，彭帮柱*，徐晓云，潘思轶

（华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

失活乳酸菌去除柑橘汁中链格孢霉毒素TeA工艺优化

葛 娜，彭帮柱*，徐晓云，潘思轶

（华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

柑橘果实易受链格孢霉菌等病原微生物的污染产生并积累链格孢霉毒素，其中细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）是毒性最强的一种链格孢霉毒素，具有潜在的致癌性和细胞毒性，对消费者的健康和安全构成严重威胁。为降低柑橘汁中TeA含量，本研究利用灭活乳酸菌菌体细胞作为吸附剂，主要研究其吸附去除柑橘汁中TeA的工艺条件。首先通过单因素试验分析灭活乳酸菌菌粉添加量、吸附时间、TeA初始质量浓度和pH值对TeA去除率的影响，然后采用响应面法Box-Behnken设计对吸附去除橙汁中TeA工艺条件进行了优化，得到最佳工艺参数为灭活乳酸菌菌粉添加量1.20 g/20 mL、吸附时间11.43 h、TeA初始质量浓度250 μg/L、橙汁pH 3.15，在此条件下，TeA去除率为86.98%。同时建立了TeA去除率与各影响因素间的二次多项式回归模型，并对该模型进行了验证，结果表明模型拟合程度高，预测效果好。

失活乳酸菌；链格孢霉毒素细交链孢菌酮酸（TeA）；吸附；柑橘汁

链格孢霉毒素细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）是链格孢霉、稻瘟病霉等在特定条件下产生的有毒代谢产物之一[1-2]，其毒素水平居各种链格孢霉毒素之首[3-4]，对蛋白质合成具有抑制作用，具有潜在的致癌性和细胞毒性，对人的健康和安全构成严重威胁[5-6]。

链格孢霉可污染谷物[7-8]、果蔬[9-11]、饮料[12-14]、婴儿食品[15]等；现有文献证实柑橘果实被链格孢霉菌株侵染后能够产生大量TeA[16-19]。但是，目前缺乏系统的风险评估、限量标准和去除方法等相关研究。

目前真菌毒素的去除方法主要有物理吸附法[20]和化学降解法[21]。无论是物理方法还是化学方法都会在一定程度上引起果汁感官品质和理化性质的变化，并且化学方法存在效果不稳定、化学物质与真菌毒素反应机理和反应后的降解产物不确定、处理成本高、操作困难等缺点。此外，在食品中添加化学添加剂是不被提倡的，在一定程度上影响食品的天然性，因此亟需建立一种安全、高效的方法去除真菌毒素。采用微生物去除真菌毒素的方法逐渐成为一个研究热点，该方法有望成为一种安全、高效解决真菌毒素污染的方法。

生物吸附法是指以酵母、乳酸菌等生物体细胞及其衍生物为吸附剂，从而实现环境及样品中污染物去除与控制的处理方法[22]。1998年，El-Nezami等[23]筛选出的乳酸菌菌株LBGG和LC-705在24 h内能结合培养基中80%的黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）（初始质量浓度为5 µg/mL）；2001年Haskard等[24]研究发现，失活鼠李糖乳杆菌和乳酸菌能够通过细胞表面结合降低AFB1。此后，使用乳酸菌去除真菌毒素成为了研究的热点[25-27]。2011年，Yue Tianli等[28]研究发现失活的苹果酒酿酒酵母能够成功地降低苹果汁中展青霉素的含量，最大吸附量可以达到70.28%；同时，有研究表明失活的乳酸菌能够去除苹果汁中的展青霉素，并且苹果汁的基本理化指标不变[29]。因此，本实验以失活的乳酸菌作为生物吸附剂去除橙汁中链格孢霉毒素TeA，通过对去除工艺条件的优化，寻找最佳的吸附条件，为柑橘汁中链格孢霉毒素TeA的有效控制提供新的思路和方法，为柑橘产业的健康发展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

短乳杆菌（Lactobcillus brevis）CICC 20023 中国工业微生物菌株保藏管理中心。

新鲜橙子购于华中农业大学农贸市场，去皮榨汁后过滤备用；橙子品种为伦晚，采收时间为2016年3月，单果质量平均约为120～150 g，无病虫害。

1.1.2 试剂

细交链孢菌酮酸铜盐（(TeA)2Cu）标准品 加拿大多伦多研究化学品公司；乙腈（色谱纯） 美国Fisher公司；酵母提取物 英国Oxoid公司；蛋白胨 北京双旋微生物培养基制品厂；甲酸（分析纯）、葡萄糖、磷酸氢二钾 国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

液体培养基：酵母膏7.5 g，葡萄糖10.0 g，蛋白胨7.5 g，磷酸氢二钾2.0 g，吐温80 0.5 mL，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0；121 ℃高压蒸汽灭菌15 min后备用。

1.2 仪器与设备

2998高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Waters公司；HU660WN-M榨汁机 韩国惠人集团；LX-C35L（数显）型高压蒸汽灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司；IS-RSVI恒温振荡培养箱 广州市鹏鑫科学仪器有限公司；Centrifuge5804R超速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Alphal-4真空冷冻干燥仪 德国M. Christ公司；UltraScan XE型色度测定仪 美国HunterLab公司。

1.3 方法

1.3.1 橙汁理化指标的测定

pH值：采用标准矫正pH计测定；色度：利用色度测定仪测定；可溶性固形物含量：采用GB 12143—2008《饮料通用分析方法》[30]中折光计法测定；总酸和总糖含量：采用SB/T 10203—1994《果汁通用试验方法》[31]中的直接滴定法测定。

1.3.2 灭活菌粉吸附剂的制备

将-80 ℃保存的菌种接种到乳酸菌液体培养基中，在30 ℃、120 r/min振荡活化24 h。按10%菌液接种量将活化后的菌液（菌液浓度为108CFU/mL）接种于液体培养基中，同样条件下扩大培养24 h后在6 000×g、4 ℃离心10 min，用蒸馏水洗涤菌泥3 次；将洗的净菌泥置于高压灭菌锅内121 ℃灭活20 min，冷却后再将预冷后的菌泥进行真空冷冻干燥。冷冻干燥后，研磨过100 目筛制得失活乳酸菌菌粉吸附剂。

1.3.3 链格孢霉毒素TeA贮备液的制备

准确称取1.0 mg细交链孢菌酮酸（铜盐）标准品，用乙腈充分溶解，定容至10 mL，得到质量浓度为100 μg/mL的标准品贮备液，冷藏备用。

1.3.4 样品中链格孢霉毒素TeA含量的HPLC检测

参照Schwarz等[32]的方法，并根据实际情况有所调整。HPLC检测条件：色谱柱C18反相柱ODS-2（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流动相：A为超纯水，B为90%乙腈（乙腈-水），均用0.1%的甲酸酸化处理并用0.45 μm滤膜抽滤后超声波脱气20 min；流速：1.0 mL/min；梯度洗脱条件：0～7 min为20%～100% B，7～10 min为100%～50% B，10～15 min为50%B，15～16 min为50%～20% B，16～20 min为20% B；进样量：20 μL；样品在检测前过0.22 μm微孔滤膜，紫外检测波长：277 nm；柱温：40 ℃。

1.3.5 单因素试验设计

1.3.5.1 灭活菌粉添加量对TeA去除率的影响

准确称0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 g灭活菌粉，用20 mL蒸馏水清洗后使用高速冷冻离心机（10 000×g，10 min，4 ℃）离心后去掉水，重复1 次，清洗后分别加入20 mL加标橙汁样品中，随后将其置于30 ℃恒温摇床中振荡吸附24 h，转速为120 r/min，评价灭活菌粉添加量对TeA去除率的影响。

1.3.5.2 吸附时间对TeA去除率的影响

分别将1.0 g水洗后的灭活菌粉加入到20 mL加标橙汁溶液中，随后将其置于30 ℃恒温摇床中振荡（120 r/min）吸附，分别于0、6、12、18、24、30、36 h取样，评价吸附时间对TeA去除率的影响。

1.3.5.3 TeA初始质量浓度对TeA去除率的影响

分别在20 mL含有500、750、1 000、1 500、 2 000 μg/L TeA的加标橙汁中加入1.0 g水洗后的灭活菌粉，随后将其置于30 ℃恒温摇床中振荡吸附12 h，摇床转速120 r/min，吸附结束后绘制去除率与TeA初始质量浓度的关系曲线。

1.3.5.4 橙汁pH值对TeA去除率的影响

以缓冲液调节橙汁pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，加入1.0 g水洗后的灭活菌粉于20 mL不同pH值的加标橙汁中，随后将其置于30 ℃恒温摇床中振荡吸附处理12 h，摇床转速120 r/min。吸附结束后绘制去除率与pH值的关系曲线。

单因素试验均以没有添加灭活乳酸菌菌粉吸附剂的加标橙汁为空白对照，每个处理设置3 个重复。所有样品吸附完成后使用高速冷冻离心机（10 000×g，10 min， 4 ℃）对橙汁溶液进行离心，弃去沉淀，上清液用HPLC检测TeA含量。

1.3.6 Box-Behnken试验设计

在单因素试验基础上，选取灭活菌粉添加量、吸附时间、TeA初始质量浓度、橙汁pH值4 个影响因素，根据响应面法中的Box-Behnken试验设计原理，利用Design-Expert 8.0.5b设计四因素三水平试验，见表1。

表1 Box-Behnken试验因素及水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 橙汁理化指标分析

鲜榨橙汁以及不同剂量的灭活菌粉对含有500 μg/L的 20 mL橙汁在30 ℃恒温摇床中振荡（120 r/min）吸附12 h后的各理化指标如表2所示。与鲜榨橙汁相比，灭活乳酸菌菌粉吸附后橙汁pH值、色度和可溶性固形物含量基本保持不变，对总糖及总酸含量的影响也很微弱。说明使用灭活菌粉吸附对橙汁的品质影响不大。

表2 橙汁的理化指标测定值Table 2 Physical and chemical properties of citrus juice

2.2 单因素试验结果

2.2.1 灭活菌粉添加量对TeA去除率的影响

图1 灭活菌粉添加量对橙汁中TeA去除率的影响Fig. 1 Effects of adsorbent dose on removal of TeA from citrus juice

由图1可知，向20 mL橙汁中分别加入0.20～1.20 g灭活菌粉时，橙汁中TeA去除率明显增大。由此可知，随着灭活菌粉剂量的增加，TeA去除率增大；当灭活乳酸菌菌粉添加量为1.0 g/20 mL时，橙汁中TeA的去除率达到最高，为71.26%，原因可能是由于菌体细胞数的增多，细胞壁上相应的结合位点增多[33]。继续加大菌粉使用量时去除率有所降低，可能是由于菌体数增多，导致菌粉之间因静电作用而产生聚合，进而减少结合位点。据研究发现，更多吸附剂可能在细胞壁上产生筛选效应，并不是所有的结合位点都有真菌毒素附着[34]，从而导致TeA去除率降低。因此确定1.0 g/20 mL为灭活菌粉的最佳吸附剂量。

2.2.2 吸附时间对TeA去除率的影响

由图2可知，随着吸附时间的延长，去除率先快速增加，12 h后逐渐达到平衡。用1.0 g灭活菌粉吸附0 h时，去除率为18.26%，该结果表明灭活乳酸菌去除TeA的作用机制可能是TeA被快速吸附到菌体表面的过程[35]；吸附6 h后，去除率为25.39%；吸附12 h后，去除率达到最高，为53.15%；当吸附时间延长至18 h时，去除率为49.82%，此时TeA去除率基本达到平衡；继续延长吸附时间对链格孢霉素TeA的去除率影响不大。因此确定灭活菌粉的最佳吸附时间为12 h。

图2 吸附时间对橙汁中TeA去除率的影响Fig. 2 Effects of adsorption time on removal of TeA from citrus juice

2.2.3 TeA初始质量浓度对TeA去除率的影响

图3 橙汁中TeA初始质量浓度对TeA去除率的影响Fig. 3 Effects of initial TeA concentration on removal of TeA from citrus juice

如图3所示，向20 mL橙汁中加入1.0 g灭活菌粉，对TeA初始质量浓度为500 μg/L的橙汁吸附处理12 h，TeA去除率为70.75%；随着橙汁TeA初始质量浓度的增大，灭活菌粉对TeA的去除率呈下降趋势，并最终达到吸附平衡。当TeA初始质量浓度为2 000 μg/L时，其去除率为47.82%。在较低质量浓度条件下，TeA能与菌体细胞表面的结合位点充分结合，从而去除率较高；在较高质量浓度条件下，TeA竞争有限的结合位点，TeA多于结合位点，导致去除率降低。因此，确定TeA最佳初始质量浓度为500 μg/L。

2.2.4 橙汁pH值对TeA去除率的影响

由图4可知，在TeA初始质量浓度为500 μg/L的橙汁中，随着橙汁pH值的升高，TeA去除率先增加后降低。在橙汁pH 4.0时具有最大去除率，为64.81%。据文献报道，pH值在真菌毒素的去除方面有显著的影响[36]。菌体表面各种活性官能团（如羧基、氨基和磷酸基等）受溶液pH值的影响较大。在pH值较低时，菌体表面带有较多的正电荷，抑制带正电荷的TeA在菌体上的吸附；随着pH值的升高，菌体表面的负电荷逐渐增多，有利于对TeA的静电吸附，因此将最佳吸附pH值定在4.0左右。

图4 橙汁pH值对橙汁中TeA去除率的影响Fig. 4 Effects of pH on removal of TeA from citrus juice

2.3 响应面试验结果

2.3.1 Box-Behnken试验设计与结果

表3 响应面Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Response surface Box-Behnken design with experimental values of TeA removal

利用Design-Expert 8.0.5b软件对表3试验数据进行多元回归拟合，得到TeA去除率（Y）对灭活菌粉添加量（A）、吸附时间（B）、TeA初始质量浓度（C）和橙汁pH值（D）的二次多项回归模型方程为：Y=75.99+2.94A+ 5.85B-11.49C-5.65D+4.05AB-8.70AC-1.81AD+18.23BC-5.72BD+8.95CD-6.06A2-18.53B2-12.53C2-9.36D2。由表4可以看出，回归模型的P值小于0.000 1且模型预测值与试验值之间有较好的相关性（R2=0.949 1），说明采用响应面法进行灭活乳酸菌去除橙汁中TeA的试验所得回归模型是有效的。由表4可知，一次项B、C、D，二次项A2、B2、C2、D2和交互项AC、BC、CD对TeA去除率有显著或极显著的影响。各因素对TeA去除率影响由大到小顺序为：TeA初始质量浓度＞吸附时间＞橙汁pH值＞灭活菌粉添加量。

表4 回归方程系数及方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model and significant test

2.3.2 各因素交互作用对TeA去除率的影响

图5 各因素交互作用对TeA去除率影响的响应面和等高线图Fig. 5 Response surface and contour plots showing the effects of variables on removal of TeA from citrus juice

从图5可以看出，灭活菌粉添加量和TeA初始质量浓度、TeA初始质量浓度和吸附时间、TeA初始质量浓度和橙汁pH值的交互作用都比较明显。从图5b可知，当橙汁pH 4、吸附时间12 h时，等高线沿TeA初始质量浓度方向变化较快，而沿菌粉添加量方向变化较慢，表明TeA初始质量浓度对TeA去除率的影响高于菌粉添加量。从图5d可知，当灭活菌粉添加量1.0 g/20 mL、橙汁pH 4时，TeA初始质量浓度变化明显快于吸附时间，在TeA较低初始质量浓度时，去除率较高。从图5f可知，在吸附时间12 h、灭活菌粉添加量1.0 g/20 mL时，TeA初始质量浓度与橙汁pH值的交互作用显著。

2.3.3 橙汁中TeA吸附预测模型的验证

为了进一步验证橙汁中TeA吸附预测模型的准确性，在灭活乳酸菌去除橙汁中链格孢霉毒素TeA的最佳工艺条件下，即：灭活乳酸菌菌粉添加量1.20 g/20 mL、吸附时间11.43 h、TeA初始质量浓度250 μg/L、橙汁pH 3.15。理论最大去除率为87.87%，实际测得TeA去除率为86.98%，两者基本一致，没有显著性差异（P＞0.05），结果表明二次多项式模型拟合程度高，预测效果好。

3 结 论

以灭活乳酸菌菌粉作为吸附剂，优化其去除橙汁中链格孢霉毒素TeA的工艺参数，在单因素试验基础之上，利用响应面法对影响去除率的因素及其交互作用进行分析，结果表明：各因素对TeA去除率的影响由大到小顺序为：TeA初始质量浓度＞吸附时间＞橙汁pH值＞灭活菌粉添加量。最优工艺参数为：灭活菌粉添加量1.20 g/20 mL、吸附时间11.43 h、TeA初始质量浓度250 μg/L、橙汁pH 3.15。在此条件下，TeA去除率为86.98%；同时建立了TeA去除率与各影响因素间的二次多项回归模型，该模型的验证结果表明模型拟合程度高，预测效果好。

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Optimization of Adsorption Removal of Alternaria Mycotoxin TeA from Citrus Juice by Inactive Lactic Acid Bacteria

GE Na, PENG Bangzhu*, XU Xiaoyun, PAN Siyi
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Citrus fruit is susceptible to pollution by Alternaria during growth and post-harvest storage. Tenuazonic acid (TeA) is considered to be one of the most toxic mycotoxins produced by Alternaria, and constitutes a serious threat to consumers’health and safety. Therefore, this study aimed to obtain the optimal conditions for adsorption removal of TeA from citrus juice using inactive lactic acid bacteria (LAB) as adsorbent. The optimization was implemented using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology with Box-Behnken design. The independent variables were adsorbent dosage, adsorption time, initial concentration of TeA and pH of citrus juice. The response variable was the percentage removal of TeA. An adsorption time of 11.43 h, 1.20 g/20 mL of inactive LAB, an initial TeA concentration of 250 μg/L and pH of 3.15 were determined as to be optimal. Under these optimal conditions, the percentage adsorption of TeA from citrus juice was 86.98%. A quadratic polynomial regression model was established and validated between the independent variables and the response. It turned out that the model had a high goodness of fit and good prediction performance.

inactive lactic acid bacteria; Alternaria mycotoxin TeA; adsorption removal; citrus juice

10.7506/spkx1002-6630-201714040

TS275.5

A

1002-6630（2017）14-0256-07

葛娜, 彭帮柱, 徐晓云, 等. 失活乳酸菌去除柑橘汁中链格孢霉毒素TeA工艺优化[J]. 食品科学, 2017, 38(14): 256-262.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714040. http://www.spkx.net.cn

GE Na, PENG Bangzhu, XU Xiaoyun, et al. Optimization of asorption removal of Alternaria mycotoxin TeA from citrus juice by inactive lactic acid bacteria[J]. Food Science, 2017, 38(14): 256-262. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714040. http://www.spkx.net.cn

2016-08-24

湖北省重大科技创新项目（2015ABA035）

葛娜（1987—），女，硕士研究生，研究方向为食品安全。E-mail：gena2007@163.com

*通信作者：彭帮柱（1978—），男，副教授，博士，研究方向为食品发酵工程。E-mail：pengbangzhu@163.com