黄丽英，王永超，顾 捷

（1.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

水产品中碱性玫瑰精残留量的UPLC-MS/MS和LCMS-IT-TOF分析

黄丽英1，王永超2，顾 捷1

（1.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

建立了水产品中碱性玫瑰精测定的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）和离子阱飞行时间质谱法（LCMS-IT-TOF）。样品经均质，以无水乙醇进行提取，通过Oasis HLB固相萃取小柱净化后进行UPLC-MS/MS和LCMS-ITTOF定性定量分析。结果表明，UPLC-MS/MS法在0.5～10.0 μg/L范围内线性相关性好，相关系数为0.999 1，回收率在70%～120%之间，相对标准偏差低于15%，检测限为0.1 μg/kg。自制阳性样品进行LCMS-IT-TOF定性，采用V飞行模式，根据正离子模式下获得的多级质谱数据，对比对照品碎裂特征，总结其多级裂解规律，进一步确证该非食用物质的添加使用。

碱性玫瑰精B；UPLC/MS/MS；LCMS-IT-TOF；水产品

碱性玫瑰精（英文名Rhodamine B），又名罗丹明B、盐基玫瑰精B、碱性荧光红8B，俗称"洋红"，溶于水和乙醇呈蓝光红色，微溶于丙酮，极易溶于乙二醇乙醚，是一种偶氮类碱性工业染料，用于染蚕丝、腈纶、羊毛，也用于皮革、纸张、麦秆着色以及制备色淀颜料[1]。虽然碱性玫瑰精用途广泛，但滥用该类工业染料仍会通过皮肤接触、呼吸吸入、直接食入等对人体导致不良的影响。我国禁止食品及农产品中添加该工业染料，但非法使用的情况还是存在，也曾发生过一起群体性碱性玫瑰精中毒事件[2]。碱性玫瑰精已被我国卫生部列为食品中可能违法添加的非食用物质名单，但由于这些色素比食用色素更易于在肉制加工品上着色，且价格低廉，一些不法食品生产经营企业为了改善水产品的外观亮泽，在生产加工过程中可能滥用非食用物质碱性玫瑰精，以谋求更大利益。

目前工业染料的检测方法主要有紫外分光光度法[3]、高效液相色谱法[4]、液相色谱串联质谱法[5-6]、飞行时间质谱法[7]等，多集中在调味料[8]和通用食品[9]上，水产品中有碱性嫩黄O的研究[10]，碱性玫瑰精的测定报道较少。液相色谱-串联质谱技术具有选择性、灵敏度、分析效率高等特点，本文建立了水产品中碱性玫瑰精的超高效液相色谱－串联质谱检测法，大幅度排除了食用色素的干扰。同时，对水产品中检出碱性玫瑰精的自制阳性样品应用液相色谱－离子阱飞行时间质谱技术进行了多级质谱的分析，进一步确证该非食用物质的添加使用，极大提高了水产品中碱性玫瑰精的风险监测质量安全分析能力。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

美国Waters液质联用仪（AcquityTMUPLC/Quattro Premier XE，MsssLynx4.1工作站）；日本岛津高效液相色谱离子阱飞行时间质谱仪（LCMS-IT-TOF，LCMSsolution V3.50工作站）；固相萃取柱（Oasis HLB 6 mL，500 mg或相当者）；固相萃取装置；涡旋混合器；超声波清洗器；离心机；旋转蒸发仪；氮吹仪。

标准物质：碱性玫瑰精（SIGMA公司，50 g/瓶），用甲醇配制成1 mg/mL的标准储备液。色谱纯：甲醇、甲酸；分析纯：无水硫酸钠、无水乙醇、氨水；超纯水。

1.2 仪器条件

1.2.1 UPLC-MS/MS法

色谱柱：Waters AcquityTMUPLC BEH Cl8柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相 A 为 0.1%甲酸甲醇溶液，B 为 0.1%甲酸水溶液，65：35（A:B）等度洗脱 5 min；柱温：30 ℃；进样体积：5 μL；流速：0.2 mL/min。

离子化方式：ESI正离子模式；离子源参数：毛细管电压3.5 kV，源温度120℃，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流量600 L/hr，锥孔反吹气流量50 L/hr；离子采集方式：多反应监测模式（MRM），选择m/z 443/399、443/355作为定性离子对，m/z 443/399作为定量离子对，采用外标法定量。

1.2.2 LCMS-IT-TOF法

色谱柱：Shimadzu Shim-pack XR-ODS C18柱（2.0 mm×75 mm,2.2 μm）；流动相 A 为 0.1%甲酸甲醇溶液，B 为 0.1%甲酸水溶液，55：45（A:B）等度洗脱 10 min；柱温：30 ℃；进样体积：4 μL；流速：0.3 mL/min。IT-TOF MS 离子化方式：ESI正离子扫描；扫描范围：MS1m/z 150～1 000，MS2m/z 100～500,MS3m/z 100～500；加热模块温度：200℃；曲形脱溶剂管温度：200℃；雾化气N2流速：1.5 L/min；干燥气流速：10 L/min；离子源电压：4.5 KV；检测器电压：1.70 KV；校准方法：自动调谐优化电压，外标法校准质量数。

1.3 试验方法

称取5 g样品（精确到0.01 g）于50 mL聚丙烯离心管中，加入5 g无水硫酸钠，搅拌均匀，加入25 mL无水乙醇，涡旋混合1 min，超声提取20 min，以8 000 r/min离心5 min，上清液转移至鸡心瓶中，再加入25 mL无水乙醇，重复上述操作，合并全部上清液于鸡心瓶中，在45℃旋转蒸发至近干，待净化。样品提取浓缩液用10 mL水少量多次溶解，上固相萃取柱（使用前分别用10 mL甲醇和10 mL水预处理，保持柱体湿润），调节流速小等于2 mL/min，用6 mL 4%氨水甲醇溶液洗脱，40℃氮气吹干，准确加入1 mL 70%甲醇水溶液定容，过0.22 μm滤膜，待测。

2 结果与讨论

2.1 UPLC-MS-MS法的TIC和MRM图

根据碱性玫瑰精的结构特征我们选择ESI（+）作为电离模式，采用流动注射的方式以10 μL/min将高浓度（5.0 mg/L）的标准溶液注入离子源中对离子源毛细管电压、锥孔电压、源温度、脱溶剂温度等作优化调节，得到碱性玫瑰精的分子离子峰443。优化碰撞室的氩气、碰撞能量等条件参数，对其子离子进行二级质谱分析，并从中选取两个子离子组成离子对，使离子对的丰度响应最大。在液质联用技术的应用中，流动相的选择除考虑色谱系统分离效果外，必须关注分离各组分进入质谱前离子化的效率，以便获得最佳的分辨率和最高的灵敏度。对碱性玫瑰精进行分离中发现，在甲醇和水中加入0.1%甲酸时，母离子峰迅速提高，经离子化后获得高灵敏度。按照上述色质谱条件分析测试碱性玫瑰精标准物质的总离子流图和多反应监测图如图1，保留时间为2.22 min。

图1 碱性玫瑰精标准物质的TIC和MRM图Fig.1 TIC and MRM chromatograms of reference substance of Rhodamine B

2.2 UPLC-MS/MS法的方法学考察

准确移取适量的碱性玫瑰精标准液，配制系列浓度，UPLC/MS/MS法在0.5～10.0 μg/L范围内呈现良好线性关系，以响应面积为纵坐标，以浓度值为横坐标，进行线性回归，回归方程Y=805.584 X+96.233 2，线性相关系数为0.999 1。通过实验确定，碱性玫瑰精B在水产品中的检出限为0.1 μg/kg，方法灵敏度高，可满足低含量样品残留检测需求。根据碱性玫瑰精的溶解性能，为了得到尽可能高的回收率，选择萃取效率高的无水乙醇作为萃取溶剂，并采用HLB固相小柱净化方式，操作简便，保证了实验条件可操作性。在空白水产品中分别添加 0.1 μg/kg、0.4 μg/kg、2.0 μg/kg 三个高中低标准品浓度，每个水平各做3次平行，以外标法计算来验证方法的回收率。实验证明，在不同添加水平下，不同水产品基质的加标回收结果在70%～120%之间，其相对标准偏差小于15%，说明碱性玫瑰精的回收率比较稳定，该方法具有一定的可靠性。取一标准溶液进行精密度测试，平行测定6次，UPLC/MS/MS法的RSD为1.25%，也符合方法学要求。

2.3 碱性玫瑰精多级质谱裂解规律

对碱性玫瑰精对照品进行LCMS-IT-TOF研究，在ESI正离子模式下有良好信号，采用direct模式，进行了五级质谱分析，推测的裂解规律如图2。

图2 碱性玫瑰精的裂解途径Fig.2 Fragmentation pathways of Rhodamine B

从电喷雾-离子阱/飞行时间质谱联用检测结果分析，碱性玫瑰精的一级质谱以准分子离子峰m/z 443.2329[M+H]+为基峰，其主要碎片离子分别为 m/z 399.170 3、355.107 7、326.077 8、311.117 9、282.091 3、255.080 4。碱性玫瑰精准分子离子m/z 443.232 9失去-C3H8产生碎片m/z 399.170 3，一级碎片又失去-C3H8产生二级碎片m/z 355.107 7。三级碎片离子m/z 326.077 8和311.117 9分别由二级碎片m/z 355.107 7失去-C3N和-CO2得到。三级碎片离子m/z 326.077 8和311.117 9分别失去-CO2和-C3N都得到四级碎片m/z 282.091 3，由碎片m/z 282.091 3失去HCN得到五级碎片m/z 255.080 4。

常规液质分析可以根据化合物质荷比来排除基质干扰提高灵敏度，但是由于低分辨率和低质量数准确度的缺点，加上传输效率的限制也会降低被检测物的灵敏度；四级杆飞行时间串联质谱具备高分辨率和高质量数准确度的特点，但只能进行2级质谱分析，而离子阱飞行时间质谱不仅具有高分辨率和高质量数准确度，还具有10级质谱功能，有利于化合物复杂裂解规律的推导。与传统的LC-MS/MS相比，LCMS-ITTOF系统可获得高精度的多级质谱数据，提供更多的化学结构信息，提高了结构解析的准确性，从而为碱性玫瑰精的定性提供了更可靠的依据。

2.4 阳性样品的确证

在UPLC-MS/MS试验条件下，自制阳性样品中检出的碱性玫瑰精与标准物质具有相同的保留时间，且样品图谱中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差小于5，可判定样品中存在对应的碱性玫瑰精。

在LCMS-IT-TOF试验条件下，通过比较自制阳性样品与对照品的多级质谱碎裂特征，一级质谱图因基质干扰无法判断，但是MS2到MS4的质谱图信息清晰，同时m/z399.170 3提取离子流图出峰时间也与标准品相符。LCMS-IT-TOF具有多级质谱扫描功能，选定母离子碎裂出子离子，MSn质谱图中可大大降低基质干扰，因此具有极佳的定性准确性。

3 结论

本实验采用超高效液相色谱串联质谱技术，建立了水产品中碱性玫瑰精的检测方法，该方法可操作性强，定性可靠，定量准确。对自制阳性样品本文还应用离子阱飞行时间质谱技术进行了确证，检测结果令人满意。新仪器、新方法、新手段的快速应用，各方法之间相互验证，保证了检测结果的可靠性和准确性。

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Determination of Rhodamine B in Fishery Products based on UPLC-MS/MS and LCMS-IT-TOF

HUANG Li-ying1,WANG Yong-chao2,GU Jie1
(1.Marine and Fisheries Institute of Zhejiang Ocean University,Marine Fisheries Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021;2.Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

A comprehensive analytical method based on ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)and high performance liquid chromatography ion tap-time-of-flight mass spectrometry(LCMS-IT-TOF)has been developed for confirmation and quantification of Rhodamine B in fishery products.The Samples were homogenized and extracted by ultrasound extraction in the solution of 25 mL anhydrous alcohol,then centrifuged at the rate of 8 000 r/min.The obtained upper clear liquid after twice extractions was distilled and the residues were redissolved with 10 mL deionized water followed by a further cleanup procedure using Oasis HLB solid phase extraction column.The residues retained in the column were rinsed with the mixture of ammonium hydroxide and methanol(4:96 by volume).Then the analysis was carriedout by UPLC-MS/MS.The results showed a good linearity in the range of 0.5-10.0 μg/mL and a LOQ of 0.1 μg/kg,with the correlation coefficient of 0.999 1.The absolute recovery ranges from 70%to 120%,with the relative standard deviation less than 15%.Further studies on confirmation of self-made positive sample was carried out with LCMS-IT-TOF.The fragmentation pathways of the compound of Rhodamine B were concluded.By compared the mass spectrometry information from self-made positive sample and the reference substance,the objective compound in the complex matrix was identified successfully.The developed method is accurate,reliable for both screening and determination the Rhodamine B pollutant in fishery products.

Rhodamine B;UPLC/MS/MS;LCMS-IT-TOF;fishery products

TS254.7

：A

2016-12-10

国家自然科学基金（31502182）；浙江海洋大学“海洋科学”省重中之重开放课题（20160107）

黄丽英（1981-），女，浙江义乌人，高级工程师，研究方向：水产品加工与质量安全.E-mail:hlypcd@163.com

1008－830X(2017)01－0025－04