秦 川，吴善球，陈保生，吴小闲，屈焜耀，刘军民，张桂芳，徐艳峰，舒顺利，孙丽华，李彦红，朱 华，黃 澜，马春梅，徐玉环，韩云林，卢耀增

1中国医学科学院医学实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心，北京 1000212美善堂生物科技(深圳)有限公司，深圳 5180003中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所生物化学与分子生物学系，北京 1000054广州中医药大学中药学院，广州 510006



·论 著·

灵芝制剂对APP/PS1双转基因阿尔茨海默病模型小鼠的行为学、生物化学和自身免疫指标的影响

秦 川1，吴善球2，陈保生3，吴小闲1，屈焜耀2，刘军民4，张桂芳4，徐艳峰1，舒顺利2，孙丽华1，李彦红1，朱 华1，黃 澜1，马春梅1，徐玉环1，韩云林1，卢耀增1

1中国医学科学院医学实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心，北京 1000212美善堂生物科技(深圳)有限公司，深圳 5180003中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所生物化学与分子生物学系，北京 1000054广州中医药大学中药学院，广州 510006

目的 评估灵芝制剂对APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(AD)小鼠行为学、生物化学和自身免疫指标的影响。方法 将44只4月龄APP/PS- 1双转基因AD小鼠随机分为AD模型组、安理申组、灵芝中剂量组和灵芝高剂量组4组，每组11只，以10只4月龄C57BL/6小鼠为对照组。水迷宫实验观测小鼠的行为学变化情况，Western blot法检测脑组织蛋白表达水平，间接免疫荧光法检测自身免疫指标。结果 定位航行实验结果显示，从第2天起，对照组、灵芝高剂量组和中剂量组寻找平台时间呈现逐渐缩短趋势，AD模型组寻找平台时间呈现逐渐增加趋势；第5天，对照组(t=5.607，P=0.000)和灵芝高剂量组(t=2.750，P=0.010)寻找平台时间较模型组明显缩短。空间探索实验结果显示，AD模型组小鼠穿越目标平台所在象限的次数(t=2.452，P=0.025)和在目标象限内滞留时间(t=2.530，P=0.020)明显少于对照组小鼠，穿越目标平台次数较灵芝组高剂量组(t=2.317，P=0.030)和灵芝中剂量组明显减少(t=2.443，P=0.030)，且目标象限停留时间较灵芝高剂量组明显减少(t=2.770，P=0.020)；灵芝高剂量组小鼠穿越目标平台所在象限的次数(t=2.493，P=0.022)和在目标象限内滞留时间(t=2.683，P=0.015)明显多于安理申组小鼠。Western blot检测结果显示，灵芝高、中剂量组小鼠脑组织中ApoA1表达水平显著高于AD模型组(P<0.01，P<0.05)；灵芝高剂量组Aβ- 40表达水平显著低于AD模型组(P均<0.05)；灵芝高剂量组小鼠脑组织中的Sty1、ApoE、ABCA1水平显著高于模型组(P<0.01，P<0.05)。安理申组(t=30.945，P=0.000)、灵芝中剂量组(t=25.639，P=0.000)和灵芝高剂量组(t=4.689，P=0.001)的血浆IgG水平明显高于对照组。结论 灵芝制剂可能改善AD小鼠行为学障碍，促进ApoA1、ApoE和Syt1的表达，抑制Aβ- 40蛋白的表达，改善小鼠的自身免疫功能。

灵芝制剂；阿尔茨海默疾病模型；生化因子；免疫化学

ActaAcadMedSin，2017,39(3)：330-335

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆能力不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经症状和行为障碍，具有较高的发病率，已成为影响人类健康的重大疾患和严重的社会公共卫生问题。目前对AD的发病原因还没有共同的认知，研究显示，心血管疾病的很多危险因子也是导致AD发病的重要因素[1]。血液和脑组织内载脂蛋白A1(apolipoprotein A1)表达水平增加及在转录水平提高载脂蛋白E(apolipoprotein E)的表达能明显改善动物的认知行为[2- 3]。载脂蛋白J(apolipoprotein J/clusterin，ApoJ)[4]和Beta-淀粉样蛋白(amyloid β，Aβ)[5]在脑内的增加可导致神经细胞严重受损。此外，大量文献显示，多种生化因子水平和结构的变化对于神经细胞的功能均有重要影响，进而可导致认知能力的降低。例如，在脑嗅球、海马、小脑皮层、脉络层等表达量最丰富的三磷酸腺苷结合盒运转体A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)[6]；对神经元的生长有促进作用的脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophi factor，BDNF)[7]和突触结合蛋白1(synaptotagmin 1，Syt1)[8]；可以调节神经元多种功能的脑内高结合蛋白钙调蛋白(calmodulin，CaM)[9]。灵芝是中国的传统中药，具有免疫调节、抗氧化和延缓衰老等多种功能，本课题组以往研究显示，灵芝制剂可能具有保护神经细胞和促进神经细胞生长的作用[10]。本研究采用灵芝制剂饲喂APP/PS1 AD小鼠，评估了灵芝制剂对APP/PS1 AD小鼠行为学、生物化学和自身免疫指标的影响。

材料和方法

实验动物及分组 4月龄APP/PS- 1双转基因AD小鼠44只，雌15只，雄29只，体重30 g左右，由中国医学科学院医学实验动物研究所遗传中心提供，清洁级动物房饲养[施合格证SYXK(京)2011- 0022]，饲料购自军事医学科学院实验动物中心[合格证SCXK- (军)2007- 005]。随机分为4组，每组11只：(1)AD模型组：雌4只，雄7只，给予普通饲料喂养；(2)安理申组：雌4只，雄7只，经饲料给予盐酸多奈哌齐[安理申，卫材(中国)药业有限公司]2 mg/kg喂养；(3)灵芝中剂量组：雌4只，雄7只，经饲料给予灵芝孢子粉和灵芝孢子油[美善堂生物科技(深圳)有限公司]各750 mg/kg；(4)灵芝高剂量组：雌3只，雄8只，经饲料给予灵芝孢子粉和灵芝孢子油各2250 mg/kg；给药时间共4个月。4月龄C57BL/6小鼠10只为对照组，雌4只，雄6只，体质量30 g左右，由中国食品药品检定研究院实验动物资源中心提供[SCXK(京)2014- 0013]，清洁级动物房饲养。

试剂和仪器 IPA裂解液(强)(江苏碧云天公司)，TEMED、Tween- 20(美国Sigma公司)，β-巯基乙醇(美国 Biotech公司)，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺(美国Bio-Rad公司)，蛋白Marker(英国Abcam公司)；ECL发光试剂盒(美国Pierce公司)，医用X线胶片、定影剂、显影剂(美国柯达公司)，ELISA试剂盒：小鼠免疫球蛋白IgG(DRE- 42122)(美国RB公司)；Syt1、p-CaMKIⅠα(Try286)、BDNF、Aβ-40、APOA1、APOE、APOJ、ABCA1抗体(英国Abcam公司),HRP-conjugated anti-GAPDH IgG、HRP-conjugated anti-rabbit IgG、HRP-anti-mouse IgG和HRP-conjugated anti-mouse IgG(中国ZSGB公司)。Ethovision XT动物轨迹跟踪及行为观察记录分析系统(荷兰Noldus公司)，组织脱水机、石蜡包埋机、石蜡切片机(德国Leica公司)，病理切片扫描成像系统(美国Aperio公司)；ImageScope图片分析软件(美国Aperio公司)，摄像头及图像采集软件(日本Olymph公司)，Image J图像分析软件(美国国立卫生研究院)。

行为学变化检测 Morris水迷宫实验观察动物的行为学变化，具体参照 Yao等[11]的方法：将直径100 cm、高50 cm的圆形不锈钢水池等分为4个象限，在目标象限中央放1个直径为9 cm、高27 cm的圆形隐藏平台，水池内水温保持(22±1)℃，水没过平台1 cm，水中加入适量奶粉，使平台隐藏于水中。水池上方用摄像机记录小鼠运动轨迹，用Ethovision XT监测分析系统进行分析。实验分定位航行实验和空间探索实验。

定位航行实验：将小鼠离平台最远两点背靠池壁放入水中，入水后60 s内爬上平台且停留3 s以上为找到平台，记录所需时间(称为Latency，即潜伏期)；60 s未能找到，潜伏期定为60 s，并将小鼠移至平台上休息15～20 s再实验，共进行5 d，上下午各1次。

空间探索实验：定向航行实验后次日撤除隐藏平台，随机选择入水点将小鼠放入水中游泳60 s，记录小鼠穿越平台象限次数和在此象限停留时间，采用Noldus Ethovision XT 行为学分析软件进行分析。

脑组织蛋白表达水平的测定 动物脱颈处死后，快速取一侧大脑称重后放入液氮中，-80℃冰箱内保存。脑组织放入冰浴RIPA裂解液中裂解、研磨、离心，取上清液测蛋白浓度后，分装并保存在-80℃冰箱备用。采用Western blot技术制备PAGE凝胶、加样品、电泳、转膜、加入抗体、在暗室对X光片曝光，用Image J软件分析蛋白色带光密度值。利用目的蛋白与内参蛋白带的光密度比值衡量目的蛋白的相对表达量，并比较不同样本目的蛋白相对表达量的高低。

血浆IgG水平的检测 采集自凝血约1.5 ml，取上清-20℃保存，采用间接免疫荧光法[12]检测IgG(ab6785，ABCAM)水平。

统计学处理 采用SPSS 16.0 统计软件，实验数据以均数±标准差表示，两两比较采用student’st检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

各组行为学变化情况的比较 定位航行实验结果显示，从第2天起，对照组、灵芝高剂量组和中剂量组寻找平台时间呈现逐渐缩短趋势，AD模型组寻找平台时间呈现逐渐增加趋势；第5天，对照组(t=5.607，P=0.000)和灵芝高剂量组(t=2.750，P=0.010)寻找平台时间较模型组明显缩短。空间探索实验结果显示，AD模型组小鼠穿越目标平台所在象限的次数(t=2.452，P=0.025)和在目标象限内滞留时间(t=2.530，P=0.020)明显少于对照组小鼠，穿越目标平台次数较灵芝组高剂量组(t=2.317，P=0.030)和灵芝中剂量组显著减少(t=2.443，P=0.030)，目标象限停留时间较灵芝高剂量组明显减少(t=2.770，P=0.020)；灵芝高剂量组小鼠穿越目标平台所在象限的次数(t=2.493，P=0.022)和在目标象限内滞留时间(t=2.683，P=0.015)明显多于安理申组小鼠(表1)。

各组脑组织蛋白质相对表达水平的比较 Western blot检测结果显示，灵芝高、中剂量灵芝组小鼠脑组织中ApoA1表达水平显著高于AD模型组(P<0.01，P<0.05)；灵芝高剂量组Aβ- 40表达水平显著低于AD模型组(P均<0.05)；灵芝高剂量组小鼠脑组织中的Sty1、ApoE、ABCA1水平显著高于AD模型组(P<0.01，P<0.05)。各组的ApoJ、P-CAM和BNDF水平差异均无统计学意义(表2)。

各组小鼠血浆IgG水平的比较 对照组、AD模型组、安理申组、灵芝中剂量组和灵芝高剂量组血浆IgG水平分别为(165.23±14.67)、(239.63±17.38)、(524.23±22.34)、(422.80±19.59)和(237.13±12.36)mg/ml，其中，安理申组(t=30.945，P=0.000)、灵芝中剂量组(t=25.639，P=0.000)和灵芝高剂量组(t=4.689，P=0.001)均明显高于对照组。

讨 论

人体血低水平的APOA1、APOC3、APOA4、ApoA2和ApoH是AD的危险因素[12]，与认知功能减退有密切关系[13]。在AD动物循环系统中高表达ApoA1可以改善动物的认知能力，消退炎症[4]。Paula-Lima等[13]研究发现，ApoA1可以结合Aβ，减轻Aβ引起的细胞毒。纯化的ApoA1和含有ApoA1的重组HDL能保护海马神经细胞，抑制Aβ产生的细胞毒性[13]。但迄今为止，除了利用直接注射的方法达到提高动物血液和脑组织ApoA1含量的措施之外[14- 15]，尚未见通过口服药物见效的报道。本研究结果显示，在饲喂灵芝的AD小鼠脑组织中，ApoA1水平较对照组和安理申组都有明显升高，同时小鼠认知行为也得到改善。

表 1 灵芝制剂对AD小鼠行为学影响±s)

LZ：灵芝；与AD模型组比较，at=5.607，P=0.000；bt=2.750，P=0.010；ct=2.530，P=0.020；dt=2.770，P=0.020；et=2.452，P=0.025；ft=2.443，P=0.030；gt=2.317，P=0.030；与安理申组比较，ht=2.683，P=0.015；it=2.493，P=0.022

LZ：Ling Zhi(Ganoderma lucidum)，at=5.607，P=0.000；bt=2.750，P=0.010；ct=2.530，P=0.020；dt=2.770，P=0.020；et=2.452，P=0.025；ft=2.443，P=0.030；gt=2.317，P=0.030 compared with AD model group；ht=2.683，P=0.015；it=2.493，P=0.022 compared with Aricept group

表 2 各组脑组织蛋白质相对表达水平的比较±s)

apoA1：载脂蛋白A1；Syt1：突触结合蛋白1；Aβ- 40：β-淀粉样蛋白40；ApoJ：载脂蛋白J；ApoE：载脂蛋白E；ABCA1；三磷酸腺苷结合盒运转体A1；P-CaM：磷酸化钙调蛋白；BNDF：脑源性神经生长因子；与AD模型组比较，at=3.662，P=0.002；bt=1.438，P=0.040；ct=2.015，P=0.006；dt=2.940，P=0.030；et=2.628，P=0.020；ft=2.047，P=0.040

apoA1：apolipoprotein A1；Syt1：synaptotagmin 1；Aβ- 40：amyloid β 40；ApoJ：apolipoprotein J；ApoE：apolipoprotein E；ABCA1：ATP-binding cassette transporter A1；P-CaM：phosphorylated calmodulin；BNDF：brian-derived neurotrophi factor；at=3.662，P=0.002；bt=1.438，P=0.040；ct=2.015，P=0.006；dt=2.940，P=0.030；et=2.628，P=0.020；ft=2.047，P=0.040 compared with model group

apoA1：apolipoprotein A1；Syt1：synaptotagmin 1；Aβ- 40：amyloid β 40；ApoJ：apolipoprotein J；ApoE：apolipoprotein E；ABCA1：ATP-binding cassette transporter A1；P-CaM：phosphorylated calmodulin；BNDF：brian-derived neurotrophi factor；at=3.662，P=0.002；bt=1.438，P=0.040；ct=2.015，P=0.006；dt=2.940，P=0.030；et=2.628，P=0.020；ft=2.047，P=0.040 compared with model group

Huang等[16]研究显示，ApoE基因型，特别是ApoE- 4基因型的携带者发生早老性痴呆的危险性远高于ApoE- 3和ApoE- 2基因型的携带者。Cramer 等[17]研究发现，ApoE的表达在转录水平上受核受体PPRAγ和肝受体RXR的双重作用。使用RXR拮抗剂Bexarotene可以使核受体活性提高，在转录水平上提高ApoE的表达水平。口服该拮抗剂，对老年AD鼠、年幼AD鼠，不论是急性实验还是慢性实验，均可以快速清除脑中的Aβ沉积，改善动物认知行为。ApoE的直接治疗作用在于清除AD模型鼠β-Amyloid，逆转其神经细胞功能。本研究结果显示，饲喂灵芝的动物脑内ApoE含量明显高于AD模型组。

Syt1在组织中和亚细胞水平的分布具有特异性，Syt1至SytXⅢ在大脑中均表达，含量最丰富的是Syt1、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ。Syt1和SytⅡ是突触囊包膜蛋白的主要组成部分。Syt- 1是脑内小突触囊泡和大致密核心囊泡特有的膜内蛋白质，在膜融合机制中发挥重要作用，对胞吐及递质释放过程皆有影响[18]。在Syt1基因敲除的小鼠海马神经元细胞中，神经递质快速同步释放被抑制[18]。近年研究表明，Syt1在Ca2+引发的神经递质快速释放过程中起到Ca2+感受器的作用。Ca2+与Syt1结合能够触发快速的突触囊泡外分泌过程。本研究结果显示，各组间的Syt1表达水平存在明显差异，灵芝高、中剂量组的Syt1表达水平均明显高于对照组和安理申组。

近年来有证据表明，脑内胆固醇代谢失衡可能与AD发病有关。ABCA1主要介导细胞内胆固醇的外流，在维持脑内胆固醇稳态上发挥作用。ABCA1在体内的表达水平比较客观地映了神经细胞的功能状态，本研究结果显示，AD小鼠饲喂灵芝制剂后，脑组织细胞ABCA1的表达水平比AD模型组明显升高，其认知功能也得到了改善。

Aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经 β-和 γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有 39～43 个氨基酸的多肽。在脑内Aβ有两个主要的异构体(Aβ- 40和Aβ- 42)，其共同特性是先形成可溶性的类椭圆形单体，进而形成不溶性缠结，即典型的铰链β结构，也就是AD患者脑中发现的淀粉样斑块[6]。它可由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，大多与伴侣蛋白分子结合，少数以游离状态存在。在2个月大的患病实验鼠体内，这种β淀粉样蛋白不是在神经细胞外部蓄积，而是直接在细胞内蓄积。研究人员还发现，随着病情进一步发展，β淀粉样蛋白在神经细胞外部的蓄积逐渐增多，年龄超过12个月的患病实验鼠大脑内，β淀粉样蛋白主要蓄积在神经细胞外部。因此，清除脑内可溶性的Aβ及Aβ斑块，将有利于记忆和学习能力的恢复。本研究结果显示，饲喂高剂量中剂量灵芝组的AD小鼠脑组织中Aβ- 40表达水平显著低于对照组和AD模型组，与安里申组水平接近，说明灵芝被AD小鼠食用在体内转化后可能有一种成分具有和安里申相似或同样的药理作用。

综上，本研究结果显示，饲喂灵芝的AD小鼠不仅脑组织内的生理生化蛋白质成分含量发生了有益的改变，其行为和认知能力也有明显提高，提示灵芝制剂可能会降低神经细胞的受损程度，保护神经细胞，今后尚需进一步研究加以证实。

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Effect of Ganoderma Lucidum Preparation on the Behavior，Biochemistry，and Autoimmune Parameters of Mouse Models of APP/PS1Double Transgenic Alzheimer’s Disease

QIN Chuan1，WU Shanqiu2，CHEN Baosheng3，WU Xiaoxian1，QU Kunyao2，LIU Junmin4，ZHANG Guifang4，XU Yanfeng1，SHU Shunli2，SUN Lihua1，LI Yanhong1，ZHU Hua1，HUANG Lan1，MA Chunmei1，XU Yuhuan1，HAN Yunlin1，LU Yaozeng1

1Center of Comparative Medicine，Institute of Medical Laboratory Animal Science，CAMS and PUMC，Beijing 100021，China2Mei Shan Tang Biotechnology(Shenzhen)Ltd，Shenzhen 518000，China3Department of Biochemistry and Molecular Biology，Institute of Basic Medicine，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China4Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，ChinaCorresponding author：CHEN Baosheng Tel：010- 63010060，E-mail：capogene@126.com；LU Yaozeng Tel：010- 63010060，E-mail：lyz_wxx@163.com

Objective To evaluate the efficacy of Ganoderma lucidum preparation on the behaviors，biochemistry，and autoimmunity parameters of mouse models of APP/PS- 1 double transgenic Alzheimer’s disease(AD).Methods A total of 44 4-month-old APP/PS- 1 double transgenic AD mice were randomly divided into AD model group，Aricept group，Ganoderma lucidum middle-dose(LZ-M)group，and Ganoderma lucidum high-dose(LZ-H)group，with 11 mice in each group.In addition，10 4-month-old C57BL/6 mice were used as the control group.Water maze test was conducted to observe the behavior changes，and the protein expressions in brain tissues were detected by Western blot analysis.The autoimmune indicators were detected by indirect immunofluorescence method.Results In the navigation experiment，the time of finding the platform was gradually shortened since the 2ndday in the control，LZ-H，and LZ-M groups，and the time of searching the platform in the AD model group gradually increased.On the 5thday，the time of finding platform was significantly shorter in control group (t=5.607，P=0.000) and LZ-H group(t=2.750，P=0.010)than AD model group.In the space exploration experiment，the number of crossing the target platform(t=2.452，P=0.025)and the residence time in the target quadrant(t=2.530，P=0.020)in AD model group mice was significantly smaller/shorter than those in control group；in addition，the number of crossing the target platform in the AD model group was significantly smaller than that in LZ-H group(t=2.317，P=0.030)and LZ-M group(t=2.443，P=0.030)，while the residence time in target quadrant decreased significantly(t=2.770，P=0.020)compared with LZ-H group；the number of crossing through the target platform quadrant(t=2.493，P=0.022)and residence time in the target quadrant(t=2.683，P=0.015)in LZ-H group were significantly higher than in Aricept group.Western blot analysis showed that the expression of ApoA1 in the brain tissues of mice in LZ-H and LZ-M groups were significantly higher than those in AD model group(P<0.01，P<0.05)；Aβ- 40 expression in LZ-H group was significantly lower than that in AD model group(P<0.05)；the expressions of Syt1，ApoE，and ABCA1 in brain tissues of mice in LZ-H group were significantly higher than those in model group(P<0.01，P<0.05).The plasma IgG level in Aricept group(t=30.945，P=0.000)，LZ-M group(t=25.639，P=0.000)and LZ-H group(t=4.689，P=0.001)were significantly higher than that in the control group.Conclusion Ganoderma lucidum preparation can improve behavior disorders of AD model mice，promote the expressions of ApoA1，ApoE and Syt1，inhibit the expression of Aβ- 40 protein，and improve the autoimmune function.

ganoderma lucidum；Alzheimer’s disease model；biochemistry factors：immune-chemistry

陈保生 电话：010- 63010060，电子邮件：capogene@126.com；

R392.11

A

1000- 503X(2017)03- 0330- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.03.006

2016- 07- 01)

卢耀增 电话：010- 63010060，电子邮件：lyz-wxx@163.com