杨 微，许 琪

中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005



·论 著·

Dysbindin- 1B+/+小鼠海马凋亡及认知功能

杨 微，许 琪

中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

目的 观察人源特异性表达dysbindin- 1B+/+(dys1B)小鼠的组织学及行为学表现。方法 建立dys1B转基因小鼠，采用TUNEL法检测野生型(WT)和dys1B小鼠海马脑区凋亡情况，并在电镜下观察WT和dys1B小鼠海马区的凋亡情况，旷场实验和T迷宫实验观测小鼠在新环境中的自主活动能力、焦虑程度及空间记忆能力。结果 dys1B小鼠海马区神经元凋亡率明显高于WT小鼠(t=12.98，P<0.0001)，且在电镜下有凋亡中期和晚期表现。旷场实验结果显示，dys1B小鼠的总运动距离为(2887±376)cm，明显低于WT小鼠的(3632±606)cm(t=2.993，P=0.0122)；中心活动时间为(64.22±14.67)s，明显少于WT小鼠的(114.00±34.09)s(t=4.649，P=0.0023)。T迷宫实验结果显示，forced run与test run间隔60和180 s时，dys1B小鼠的正确率分别为(70.40±15.17)%和(59.28±9.10)%，明显低于WT小鼠的(91.67±13.94)%(t=3.261，P=0.0258)和(83.33±14.89)%(t=3.687，P=0.0291)；间隔15 s时，dys1B小鼠和WT小鼠的正确率差异无统计学意义[100%比(94.45±6.08)%；t=0.851，P=0.0756]。结论 dys1B表达可引起小鼠海马区细胞凋亡并可导致自主活动能力降低，焦虑程度增加，空间记忆能力障碍。

dysbindin- 1；细胞凋亡；自主活动；焦虑程度；认知障碍

ActaAcadMedSin，2017,39(3)：307-311

精神分裂症是一组病因未明的重性精神疾病，多在青壮年缓慢或亚急性起病，终身患病率约为1%。小肌营养蛋白结合蛋白(dystrobrevin-binding protein 1，DTNBP1)是精神分裂症主要的易感基因之一[1]，其编码的dysbindin- 1在人体内存在dysbindin- 1A、1B、1C 3种异构体[2]。研究表明，偏执型精神分裂症患者DTNBP- 1b mRNA表达升高且聚集于核旁形成aggresome样结构[3]，提示dysbindin- 1B聚集体可能造成神经元损伤，形成特定的病理特征，最终参与精神分裂症的阴性症状、阳性症状和认知功能障碍的形成。本研究观察了人源特异性表达的dysbindin-1B+/+(dys1B)小鼠海马区的凋亡情况及其行为表现。

材料和方法

dysbindin- 1B+/+转基因小鼠模型的建立和取材 dysbindin- 1B+/-转基因小鼠由北京百奥赛图基因生物技术有限公司建立。利用得到的dysbindin- 1B+/-转基因小鼠和Cre小鼠进行交配，获得全基因敲除的杂合子小鼠，再由敲除杂合子小鼠互交得到敲除纯合子dys1B小鼠。所得新生小鼠1周内剪鼠尾进行PCR，鉴定转基因动物的基因表型，保留阳性小鼠。野生型(wild type，WT)基因PCR 产物长169 bp，dysbindin- 1B基因PCR 产物长209 bp。同窝生4月龄WT小鼠12只、dys1B小鼠12只(北京协和医学院实验动物中心)，24 h明暗各半条件饲养，取海马组织块并制作海马区石蜡切片。

TUNEL凋亡检测 采用TUNEL BrightGreen试剂盒(万类生物科技有限公司)，用PBS稀释蛋白酶K至20 μg/ml，加至脱蜡入水后的样品片上室温放置20 min。室温下PBS洗样品片3次，每次3 min，样品片上加TdT标记缓冲液20 μl/片，37℃于湿盒中标记60 min；PBS洗3次，每次3 min；DAPI染核，常规封片，镜检。

电镜观察 采用1 ml戊二醛灌流小鼠，在4℃下取出海马组织块于多聚甲醛-戊二醛固定液中固定24 h，用pH 7.3 0.1 mol/L PBS 缓冲液冲洗并过夜，逐级缓慢脱水，Epon812 浸透和包埋，超薄切片，醋酸铀(铅)双染色，TEM- 1400plus透射电镜(日本电子株式会社)观察。

旷场实验 观察小鼠在新环境中的自主活动能力和焦虑程度。将小鼠置于开口的白色盒子(内部场地大小为81 cm×81 cm，高28 cm)。盒底漆成纵横各3条黑线(宽3 mm)，从而形成16个等大的方格(每格大小20 cm×20 cm)。照明来自一高出场地中央2.80 m 的40 W白炽灯，于安静环境下进行实验。每只小鼠接受1次测试，将小鼠面朝墙放入4个拐角方格之一，让其自由探索环境5 min。每只小鼠测试结束后，湿布洗擦场地并用干布擦干。采用SMART数据自动采集和处理系统，记录小鼠运动总路程、中间场时间、跨越方格总数和站立次数。

T迷宫 训练前2 d，抚摸小鼠并将其放入T迷宫适应5 min，在迷宫两臂碗里放入食物，待小鼠取食完毕后将其取出。训练实验：每个实验包括Forced run和Test run两部分。Forced run：任意选择T迷宫的一臂，用木闸门将之关闭，小鼠只能进入一臂获取食物。取食完毕，立即取出，用酒精清洗去除气味。15 s后，撤去所有的闸门。Test run：两臂全部打开，将小鼠放入开始臂中，若小鼠选择未曾进入的臂，为正确选择，给予食物奖励；若重复进入相同的臂，则为错误选择，不给予食物。每只动物每天进行8次实验(上午4次，下午4次)，每次间隔15 min，连续2 d，分别计算每天每组小鼠的正确率。当平均正确率都达到85%以上，训练阶段结束。测试实验：设置Forced run和Test run之间的时间间隔为15、60、180 s，分别计算每组小鼠的正确率。

统计学处理 采用Graphpad Prism 5.0统计软件，所有结果以均数±标准误表示，先进行方差齐性检验；若P<0.05，则进行Welch’s检验，若P>0.05，则进行双尾非配对t检验；组间不同时间变化情况的比较采用Two-way ANOVA分析。

结 果

dys1B小鼠基因表型的鉴定 WT基因PCR 产物长169 bp，dysbindin- 1B基因PCR 产物长209 bp(图1)。

dys1B小鼠海马区出现凋亡 TUNEL+细胞的核呈绿色，形态呈碎点状、不规整、大小不一。在WT小鼠海马区未见TUNEL+神经元，dys1B小鼠海马则可见较多TUNEL+细胞，主要分布在齿状回(dentate gyrus，DG)区(图2A)。dys1B小鼠海马区神经元凋亡率明显高于WT小鼠(t=12.98，P<0.0001)(图2B)。透射电镜下可见WT小鼠海马区存在典型突触结构，细胞结构正常。细胞核形态规则，染色质均匀分布，细胞器丰富。粗面内质网分布规则，网腔均匀一致。线粒体发达，排列密集(图2C)；dys1B小鼠海马神经元细胞则出现不同程度的凋亡改变。核膜变薄并轻度下陷，核内染色体分布不均、颗粒化、凝集成块并呈半月形。线粒体肿胀，粗面内质网网腔不规则，核糖核蛋白体脱颗粒。高尔基器形态不规则，肿胀，极性消失(图2D)。核呈固缩性改变，染色质凝集成块，边集；还可见核碎裂，形成凋亡小体(图2E)。

1：转基因杂合小鼠; 2：DL2000 marker; 3～14：dys1B转基因纯合小鼠

1：dys1B heterozygous mouse; 2：DNA molecular weight marker DL2000; 3- 14：homozygous mice

图 1 PCR 鉴定dys1B转基因动物的凝胶电泳分析

Fig 1 Gel electrophoresis for the identification of dys1B transgenic mice by PCR

dys1B小鼠的旷场行为变化 旷场实验结果显示，dys1B小鼠的总运动距离为(2887±376)cm，明显低于WT小鼠的(3632±606)cm(t=2.993，P=0.0122)；中心活动时间为(64.22±14.67)s，明显少于WT小鼠的(114.00±34.09)s(t=4.649，P=0.0023)；dys1B小鼠和WT小鼠在跨格次数[(210.00±23.14)次比(214.80±19.61)次；t=0.4388，P=0.6724]及站立次数[(52.67±17.75)次比(66.92±16.6)次；t=1.655，P=0.124]方面差异均无统计学意义；两组小鼠的运动轨迹见图3。

dys1B小鼠认知功能变化 T迷宫实验结果显示，Forced run与Test run间隔60和180 s时，dys1B小鼠的正确率分别为(70.40±15.17)%和(59.28±9.10)%，明显低于WT小鼠的(91.67±13.94)%(t=3.261，P=0.0258)和(83.33±14.89)%(t=3.687，P=0.0291)；间隔15 s时，dys1B小鼠和WT小鼠的正确率差异无统计学意义[100%比(94.45±6.08)%；t=0.851，P=0.0756]。

讨 论

蛋白合成与降解的不平衡可导致大量蛋白形成不可溶的聚集体，而聚集体的形成与传播又会直接或间接对神经元的正常功能造成损伤。精神分裂症作为一种慢性精神疾病，由于未找到明确的病理诊断[4]，并不属于典型的神经退行性疾病。但仍有很多研究者致力于精神分裂症神经病理的研究，其方向主要集中在精神分裂症断裂基因1(disrupted in schizophrenia 1，DISC1)和dysbindin- 1。

DISC1是精神分裂症最重要的易感基因之一。研究表明，在部分具有精神分裂症表型的尸检脑组织样品中可检测到显著不溶的DISC1聚集体[5- 7]。此外，在部分慢性精神疾病患者尸检脑组织中，研究者发现DISC1与dysbindin- 1共同存在于不可溶的沉淀中[5]。

DTNBP1位于人类染色体6p22.3，主要有DTNBP1a、1b、1c 3种选择性剪接体，分别编码蛋白dysbindin- 1A[8]、- 1B[3，9]、- 1C[10]。有研究报道，偏执型精神分裂症患者的外周血中DTNBP1b的表达显著升高，而对单核苷酸多态性(single nucleotide poly-morphism，SNP)筛查发现，rs117610176的C位点使DTNBP1b表达升高，且编码的dysbindin- 1B有聚集成aggresome的倾向[3]。提示对于有该SNP的精神分裂症患者，高表达的dysbindin- 1B有可能形成特定的神经病理。因此，本研究观察了dysbindin- 1B高表达对于小鼠海马神经元及行为的影响。结果显示，在dys1B小鼠的海马中，高表达的dysbindin- 1B可造成海马区神经元的凋亡，以DG区最为显著。在透射电镜下可观察到处于凋亡中期和晚期的神经元。行为学研究则发现，与WT小鼠相比，dys1B小鼠表现出自主活动能力降低、焦虑程度增加和记忆能力减退。

CA：安蒙角；DG：齿状回；a：t=12.98，P<0.0001

CA：cornu ammonis；DG：dentate gyrus；a：t=12.98，P<0.0001

A.WT小鼠海马区未见凋亡细胞，dys1B小鼠海马区出现大量TUNEL+细胞；B.dys1B小鼠海马区神经元凋亡率明显高于WT小鼠；C.WT小鼠海马神经元可见较典型突触结构(箭头)；D. dys1B小鼠海马神经元可见细胞凋亡中期的形态学改变(箭头)；E. dys1B小鼠海马神经元可见较典型凋亡小体结构(箭头)

A.while there is no TUNEL+cell in hippocampus of WT mice，a large number of TUNEL+cells are seen in hippocampus of dys1B mice; B.the proportion of the apoptosis cells in hippocampus of dys1B mice is larger than that in hippocampus of WT mice; C.normal synaptic junction of hippocampus of WT mice (arrow)；D.middle-stage apoptotic changes of hippocampus of dys1B mice (arrow); E.late-stage apoptotic changes of hippocampus of dys1B mice (arrow)

图 2 Dysbindin- 1B表达导致海马区细胞凋亡

Fig 2 Dysbindin- 1B expression induces apoptosis in hippocampus

图 3 两组小鼠旷场实验的运动轨迹

Fig 3 Movement track of WT and dys1B mice in open field

目前很多研究表明，海马参与了情绪、焦虑行为以及初级认知功能，且功能的区分与形态结构上腹侧海马和背侧海马的分区有关。腹侧海马被认为参与情绪及焦虑行为的控制，而背侧海马被认为参与初级认知功能[11]。本研究结果发现，dys1B小鼠无论腹侧海马还是背侧海马都有较多TUNEL+细胞，说明整个海马区域都有损伤，以DG区最为严重，这提示相较于WT小鼠，dys1B小鼠可能有明显的情绪异常及初级认知功能损伤。因此，本研究又采用旷场实验和T迷宫实验来检测dys1B的行为。在旷场实验中，dys1B小鼠表现出总运动距离降低，中心活动时间减少，而跨格次数及站立次数无明显变化。由于跨格次数以及站立次数无明显变化，说明dys1B小鼠同WT小鼠一样具有较好的适应性。通常小鼠喜欢在较暗的地方活动，而dys1B小鼠较WT小鼠中心活动时间减少可表明dys1B小鼠自主活动能力降低。在跨格次数无明显差异的情况下，dys1B小鼠总运动距离显著降低，提示dys1B小鼠焦虑程度增加，推测这可能由于dysbindin- 1B+/+损伤腹侧海马神经元，导致腹侧海马神经递质转运异常所致[12]。而T迷宫实验结果则表明，dys1B小鼠空间记忆能力降低。

综上，本研究结果显示，与WT小鼠相比，dys1B小鼠海马区出现显著凋亡，且具有行为表型，表现为自主活动能力下降，焦虑程度增加以及认知功能障碍，提示海马区凋亡可能作为特定的精神分裂症患者的病理表现协助诊断。

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Hippocampal Apoptosis and Cognitive Function in Dysbindin- 1B+/+Mice

YANG Wei，XU Qi

State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Department of Biochemistry and Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005，ChinaCorresponding author：XU Qi Tel：010- 69156432，E-mail：xuqi@pumc.edu.cn

Objective To explore the apoptosis in the hippocampus of dysbindin- 1B+/+mice and the behaviors of 4-month-old dysbindin- 1B+/+mice and wild-type mice. Methods The hippocampus of dysbindin- 1B+/+mice and corresponding wild-type mice were assessed by TUNEL assay and transmission electron microscopy. Then twelve 4-month-old male dysbindin- 1B+/+mice and twelve wild-type mice were enrolled. The open field and T maze test were conducted to observe locomotor activity，exploratory behaviors，and spatial memory. Result TUNEL+neurons were found in hippocampus of dysbindin- 1B+/+mice，especially in dentate gyrus region，but not in that of wild-type mice(t=12.98，P<0.0001). Transmission electron microscopy showed the presence of middle-and late-stage apoptosis in the hippocampus of dysbindin- 1B+/+mice，while there was no apoptosis in wild-type mice. Open field test showed that，compared with the moving distance of wild-type mice [(3632±606)cm]，dysbindin- 1B+/+mice presented significantly lower moving distances [(2887±376)cm] (t=2.993，P=0.0122). Meanwhile，compared with the moving time of wild-type mice in the central area [(114.00±34.09)s]，dysbindin- 1B+/+mice presented lower moving time [(64.22±14.67)s] (t=4.649，P=0.0023). T maze test showed that when the interval between forced run and test run were 60 s and 180 s，respectively，the accuracy of dysbindin- 1B+/+was (70.40±15.17)% and (59.28±9.10)%，which was significantly lower than those of wild type mice (91.67±13.94)% (t=3.261，P=0.0258) and (83.33±14.89)% (t=3.687，P=0.0291)；when the interval was 15 s，there was no significant difference between these two groups [100%vs.(94.45±6.08)%;t=0.851，P=0.0756]. Conclusion Dysbindin- 1B+/+expression can cause the apoptosis of neurons，which may cause anxious behavior and impair the locomotor activity and spatial memory.

dysbindin- 1; apoptosis; locomotor activity; exploratory behavior; cognition impairment

国家重点基础研究发展计划项目(973计划)(2013CB531301、2012CB517902) Supported by the National Basic Research Program of China (973 Program)(2013CB531301，2012CB517902)

许 琪 电话：010- 69156432，电子邮件：xuqi@pumc.edu.cn

R361；R749.3

A

1000- 503X(2017)03- 0307- 05

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.03.002

2016- 01- 29)