非酒精性脂肪性肝病患者PNPLA3基因rs139051 C＞ T多态性分析

2017-07-05李晖郑丹姜挺吴杰

山东医药 2017年22期

关键词：脂肪性甘油三酯酒精性

李晖，郑丹，姜挺，吴杰

(华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院，武汉 430000)

非酒精性脂肪性肝病患者PNPLA3基因rs139051 C＞ T多态性分析

李晖，郑丹，姜挺，吴杰

(华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院，武汉 430000)

目的观察非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者patatin样磷脂酶域3(PNPLA3)基因rs139051 C>T多态性。方法将100例NAFLD患者作为观察组，同时选取100例健康志愿者作为对照组，使用PCR-LDR对两组PNPLA3基因rs139051行单核苷酸多态性分型，采用logsitic回归分析rs139051基因型与ALT、血糖、甘油三酯、胆固醇、肝脏纤维化程度指标(NFS评分、Fibroscan分级)的关系。结果观察组、对照组PNPLA3基因rs139051 CC基因型分别为10、39例，TC基因型分别为48、24例，TT基因型分别为42、37例，两组相比P均<0.01。相对于CC基因型，TC+TT基因型ALT、血糖、甘油三酯、胆固醇、NFS评分、Fibroscan分级的OR(95%CI)分别为1.94(0.50～7.50)、2.33(0.60～9.08)、4.00(1.04～15.32)、1.11(0.27～4.65)、4.29(1.12～16.52)、4.93(1.27～19.13),P分别为0.34、0.22、0.04、0.88、0.03、0.02。结论 NAFLD患者中PNPLA3基因rs139051基因型TC、TT比例高，且更易促进NAFLD进展。

patatin样磷脂酶域3；单核苷酸多态性；非酒精性脂肪性肝病；危险因素

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)包括单纯脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎、非酒精性脂肪肝炎相关肝硬化及肝细胞癌[1～3]。近年来NAFLD的发病率不断上升[4～7]，发病机制十分复杂，除了环境因素、肥胖、胰岛素抵抗外，基因变异也起到十分重要的作用[8]。patatin样磷脂酶域3(PNPLA3)是一种编码481氨基酸的非分泌性蛋白，在甘油三酯的水解中发挥重要作用，在肝脏中高表达[9]。在NAFLD的基因突变中，PNPLA3基因rs738409[10]、rs139051[11,12]的突变备受关注，rs139051在亚洲人群中的相关研究较少，在NAFLD中的具体作用尚存在争议。2015年2月～2016年2月，本研究分析了NAFLD患者PNPLA3基因rs139051 C>T的多态性，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2010年2月～2015年2月入住武汉市中心医院的NAFLD患者100例，设为观察组，其中男65例、女35例，年龄(42.7±9.8)岁。纳入标准：影像学诊断确定脂肪肝表现，如肝实质回声弥漫性增大等，同时肝脏穿刺病理活检确定具有NAFLD病理特征。排除标准：感染HBV、HCV者；每日饮酒量≥20 g；患有其他肝脏疾病如自身免疫性肝炎、药物性肝炎、血色病、Wilson病、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎。同时随机选取100例健康志愿者，设为对照组，其中男50例、女50例，年龄(43.2±10.3)岁。纳入标准：超声检查无脂肪肝表现；肝生化指标正常；每日饮酒量<20 g；无糖尿病、高血压等代谢综合征。所有试验对象签署知情同意书，本研究征得医院伦理委员会批准。

1.2 PNPLA3基因rs139051 C>T多态性观察方法 PNPLA3基因rs139051基因分型由上海天昊生物科技有限公司完成。使用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物科技有限公司)提取所有研究对象血液样本。测序方法使用PCR-LDR方式，在rs139051C>T位点两侧设计PCR引物，上下游分别为5′-TAGCAGAGAAAGCCGACTTA-3′，5′-GCCCATGGGTCTCATCTATT-3′。PCR扩增使用NEB公司Q5高保真PCR酶，反应条件98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s、62 ℃ 20 s、72 ℃ 25 s共30个循环，72 ℃ 2 min，产物长度为280 bp，琼脂糖电泳确定条带大小后与基因多态性位点的特异性探针连接，并使用ABI3730 XL DNA测序仪检测基因分型，基因型包括TT、TC和CC型。

1.3 统计学方法采用SPSS20.0统计软件。计数资料比较用χ2检验。将观察组患者ALT、甘油三酯、血糖、胆固醇、NFS评分(肝脏纤维化程度指标)分别取平均值，高于平均值即认为表达量高。rs139051基因型与ALT、血糖、甘油三酯、胆固醇、NFS评分、Fibroscan分级(将肝脏纤维化划分为F0、F1、F2、F3、F4五个等级，其中F0为无肝纤维化、F1为轻度肝纤维化、F2为中度肝纤维化、F3为重度肝纤维化、F4则为肝硬化)的关系使用logsitic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组PNPLA3基因rs139051 C>T多态性观察结果见表1。

表1 两组PNPLA3基因rs139051 C>T多态性观察结果

注：与对照组相比，*P<0.01。

2.2 观察组rs139051基因型与临床进展相关指标的关系见表2。

表2 观察组rs139051基因型与临床进展相关指标的关系

3 讨论

NAFLD的发病因素除环境因素、肥胖、胰岛素抵抗外，PNPLA3占据十分重要的作用[13]。PNPLA3位于染色体22号位长臂1区3带3亚带1次亚带，编码的蛋白称之为脂肪滋养蛋白，是一种与脂肪降解相关的、主要在肝脏中表达的基因，能够分解甘油三酯[14]和拮抗乙酰转移酶[15]的活性，与体内脂肪的储存、能量代谢的水平密切相关。研究发现，PNPLA3特定位点的点突变能显著影响PNPLA3的功能活性[16]，其中最重要的突变为rs738409位点的突变。rs738409位点中CG的突变引发翻译蛋白的错义变异，将148位异亮氨酸突变为蛋氨酸，导致PNPLA3脂肪酶的活性消失，从而大幅增加患者发生NAFLD的风险。rs738409突变还被证实与肝脏脂肪变性、炎症、纤维化和肿瘤相关，且该因素独立于患者的年龄、性别、BMI和稳态模型评估指数。研究[17]发现，PNPLA3的突变能够增加肝损指数但是与胰岛素抵抗的发生无关。PNPLA3在不同人群具有异质性，在不同地区不同种族的成人中，PNPLA3基因的多态性均与肝脏炎症相关，一些研究也认为与不同种族间NAFLD易感性以及发生率相关，其中在欧美人群中的作用且与丙型肝炎病毒效应之间的关系已被广泛认识。亚洲人群与欧美人群在基因表型、药物反应性、免疫系统方面均不同，PNPLA3目前在亚洲人群的研究较少[18]。与rs738409 不同，rs139051的突变位点位于内含子中，不引起PNPLA3功能的改变，通常认为并不能对PNPLA3基因功能产生决定性影响。但rs139051位点的A>G突变被证实能够显著影响PNPLA3翻译，且与NAFLD活动积分中的脂肪变性、小叶炎症密切相关。Liu等[19]认为，rs139051 A>G并不能够独立影响NAFLD的疾病风险，而Peng等[12]认为rs139051 TT基因型与NAFLD发病显著相关。

本研究结果表明，观察组PNPLA3基因rs139051的TC、TT基因型高于对照组，其中TC+TT基因型在观察组中占90%，在对照组则仅为63%，表明NAFLD患者TC+TT基因型比例高。logistic回归分析结果显示，在NAFLD患者中，与常见纯合子基因型CC相比，TC+TT基因型ALT、甘油三酯、胆固醇OR均>1且P>0.05，表明以上指标与NAFLD不相关，而在血糖指标中，OR>1且区间>1，表明TC+TT与血糖呈正相关，该结果与之前研究[12]结果不同。本研究在分析肝脏纤维化程度指标NFS评分和Fibroscan分级发现，与常见纯合子基因型CC相比，TC+TT基因型OR分别为4.29、4.93，且区间>1，P均<0.05，表明TC+TT基因型为肝脏纤维化的危险性因素，能够促进NAFLD的进展。

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吴杰(E-mail: wujiezxhospital@hotmail.com)