李盼盼，袁晓龙，郑 璇，高 林，刘新民，张忠锋，张 鹏，申国明*

（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

烟草内生真菌多样性及其细胞毒活性初步研究

李盼盼1,2，袁晓龙1，郑 璇1,2，高 林1，刘新民1，张忠锋1，张 鹏1，申国明1*

（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

为研究烟草内生真菌的生物多样性，揭示其在烟草中的分布规律及种群结构，对烟草栽培种的内生真菌进行了系统的分离和鉴定，并对其发酵粗提物进行了初步的细胞毒活性筛选。结果发现，采用组织分离法从健康烟株的根、茎、叶中共分离纯化到62株内生真菌，形态学和分子生物学鉴定为4目7科9属。发现叶部内生真菌的分离率最高，其次为茎，根部最少。采用CCK-8法对内生真菌的体外细胞毒活性进行筛选，发现多数菌株对人肾癌Caki-1细胞和人肝癌HepG2细胞均具有不同程度的抑制活性，菌株TE-6L的PDB发酵液及大米发酵物对Caki-1细胞48 h内的IC50分别为13.28和0.36 μg/mL。结合形态学特征和分子生物学鉴定TE-6L菌株为Fusarium sambucinum。研究表明，烟草中蕴含丰富的具有细胞毒活性的内生真菌资源，为寻找细胞毒活性物质新来源、开发新型抗肿瘤药物提供了新的途径。

烟草；内生真菌；种群分布；代谢产物；细胞毒活性

植物内生真菌（endophytic fungi）是指生活于健康植物组织或器官内，并与宿主植物建立了互利共生关系的真菌，是植物体微生态系统的重要组成部分[1]。其普遍分布于各种陆生和水生植物中，如禾草植物[2-4]、药用植物[5-7]、经济林木[8]、海洋植物[9-10]等。研究证明，内生真菌在宿主植物的生长发育中起着积极作用，能促进植物生长、诱导植物产生抗病性、提高植物对重金属的耐性等[11-13]。更为重要的是，在与宿主的协同进化过程中，内生真菌可以代谢产生具有生理活性的物质，如抑菌[14-15]、氧化[16-17]、促生长因子[18-19]、细胞毒[20-21]活性物质等。如STIERLE等[22]从药用植物短叶红豆杉树皮中分离得到一株内生真菌安德氏紫杉霉Taxomycesandreanae，从该菌的发酵产物中分离获得抗癌药物紫杉醇（taxol）。随后，从多种植物中陆续分离到产紫杉醇或其类似物的内生真菌菌株[23-25]。因此，寻找和发掘具有潜在的、高效的细胞毒活性物质的内生真菌资源，为抗肿瘤药物的研究和开发提供了新的途径。

烟草（NicotianatabacumL.）作为一种历史悠久的药用植物，蕴含着丰富的内生真菌资源。目前关于烟草内生真菌的研究主要集中在促进烟草生长、提高烟株抗重金属能力、生防抑菌等方面[26-28]，而对其代谢产物生物活性的研究尚未见报道。本试验在分离鉴定烟草内生真菌的基础上，首次对其代谢产物的细胞毒活性进行研究，为烟草内生真菌资源的有效利用、开发新型细胞毒活性先导化合物奠定基础。

1 材料与方法

1.1试验材料

健康烟草植株，品种为中烟102和云烟97，于2016年6月采于安徽皖南烟草示范园。

1.2试剂与仪器

乙酸乙酯、二甲基亚砜（DMSO）均为分析纯，国药；CCK-8（Sigma 公司），胎牛血清（杭州四季青公司）。

超净工作台、CO2培养箱（Heal Force公司），生化培养箱（上海新苗公司），光学显微镜（Nikon公司），酶联免疫测定仪（Thermo公司），立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅）。

1.3肿瘤细胞株来源与培养基

人肾癌Caki-1细胞、人肝癌HepG2细胞购于中国科学院细胞库。肿瘤细胞株采用RPMI 1640及MEM培养基培养，使用前均加入10%胎牛血清。

1.4烟草内生真菌的分离纯化

烟草内生真菌的分离采用组织分离法[29]。取健康烟株的根、茎、叶，自来水冲洗后采用75%酒精浸泡消毒2~4 min。将不同组织剪切成0.5 cm×0.5 cm大小的片段，将切口插入PDA培养基上（为抑制细菌的生长，需预先加入质量分数为0.5%的氯霉素），28 ℃培养。在另一平板设置未经过表面消毒的组织作为对照。待培养基中组织切口处长出菌丝后，用灭菌的接种环挑取孢子或菌丝体至新的PDA培养基上，划线稀释分离，直至获得纯培养。

1.5内生真菌的形态观察及分类鉴定

将纯化的菌株点植于PDA培养基上，28 ℃恒温培养，注意观察菌株的生长速度、菌落大小、质地、边缘等形态特征，同时观察分生孢子或菌丝体的显微结构特征。采用CTAB法提取纯化菌株的基因组DNA[30]，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测条带完整性，利用nanodrop检测DNA的纯度和浓度，以ITS1和ITS4通用引物进行PCR扩增[31]，然后将PCR产物送青岛擎科生物工程有限公司利用Sanger测序平台进行测序。通过BLAST序列比对，最终确定菌株的分类地位[32]。

1.6内生真菌的发酵培养及粗提物浸膏的制备

将不同种属的20株内生真菌分别接种于PDB液体培养基和大米固体培养基上，室温静置发酵30 d。发酵结束后，分别向PDB及大米培养基中加入等积体的乙酸乙酯萃取。萃取3次后过滤，减压浓缩获得粗提物浸膏作为活性待测样品。

1.7细胞毒活性测定

采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法[33]，常规胰酶消化收集对数生长期的人肾癌Caki-1细胞和人肝癌HepG2细胞，按1×105细胞/孔的量分别接种于96孔培养板中，于5% CO2，37 ℃的条件下培养过夜。次日使用100 μL含有不同浓度待测样品的培养液进行全换液后，同样条件下继续培养。24、48 h后，加入10

μL的CCK-8溶液，培养4 h后，用酶标仪在450 nm下进行吸光度（A）测定，以生长抑制率表示肿瘤细胞的增殖抑制活性。

生长抑制率=（1-A1/A2）×100%

其中，A1为样品组吸光值，A2为对照组吸光值。

1.8数据分析

所有试验均重复3次，细胞毒活性测试数据均使用均值±标准差（x±s）表示，各组数据采用SPSS 19.0统计软件进行t检验分析。

2 结 果

2.1烟草内生真菌多样性及菌群组成

从安徽皖南采集的健康烟草的根、茎、叶中共分离得到内生真菌62株，发现不同的组织中内生真菌的种群数量存在差异性。其中，从叶部分离29株，占菌株总数的46.8%；茎部分离24株，占菌株总数38.7%；根部分离9株，占菌株总数14.5%（图1）。

通过形态观察，结合分子生物学鉴定，将分离到的内生真菌鉴定为4目7科9属。如表1所示，格孢菌目为优势菌群，占分离总菌株数的61.3%。在属水平上，茎点霉属Phoma和镰刀菌属Fusarium为优势属，分离率分别为32.3%和29.0%。其在不同的组织中存在专化性。叶部Fusarium和Phoma为优势属；茎部优势属也为Fusarium和Phoma；根部Phoma为优势属。附球菌属Epicoccum、小球腔菌属Leptosphaeria以及毛霉属Mucor只分布于叶中（图1）。由此可见，烟草内生真菌具有丰富的多样性，其种群结构和数量分布具有一定的组织偏好性和组织专化性。

2.2细胞毒活性测试结果

对分离获得的20株不同种属的内生真菌进行细胞毒活性测试。为充分发掘其活性潜力，获得高活性发酵产物，采用液态培养基（PDB培养基）和固体培养基（大米培养基）两种培养方式。其中菌株TE-1S、TE-6L、TE-14L的PDB发酵粗提物，TE-6L、TE-8L、TE-20R的大米发酵粗提物在48 h内的IC50＜40 μg/mL（表2）。其对人肝癌HepG2细胞的抑制率也呈浓度-时间依赖性，但具有抑制效果的菌株数量较少，且48 h内IC50均高于40 μg/mL（表2）。以上研究表明，烟草内生真菌的发酵产物具有一定程度的细胞毒活性，特别是对人肾癌Caki-1细胞表现出更加显著的活性，且大米发酵物的抑制效果明显优于PDB发酵液，表明固体培养基更有利于细胞毒活性代谢产物的生成。

2.3活性菌株的形态鉴定

在上述细胞毒活性筛选中，发现一株来源于叶部的菌株TE-6L，其PDB发酵液及大米发酵物对Caki-1均具有显著的抑制活性，48 h内IC50分别为13.28和0.36 μg/mL，提示该菌株在不同培养条件下均有产细胞毒活性代谢产物的能力。该菌株在CYA、MEA和YES平板上为淡粉色菌落，菌丝体为绒毛状，分生孢子为镰刀状（图2），初步鉴定为镰刀菌属Fusarium真菌。利用通用引物ITS1和ITS4经PCR反应从该菌基因组DNA中扩增出长度为507 bp的单一DNA条带，将该序列进行BLAST检索，发现该菌株与接骨木镰刀菌Fusariumsambucinum（序列号：KM231813.1）具有较高的同源性，其相似度为99%，因此将该菌株初步鉴定为F. sambucinum。该发现为发掘新型抗肿瘤先导药物提供了新来源。

图1不同属的内生真菌在根茎叶中的分布及数量Fig. 1 Numbers and distribution of isolates of different genera

表1烟草内生真菌种群组成Table 1 The composition of endophytic fungi isolated fromN. tabacum

表2烟草内生真菌发酵产物对肾癌Caki-1细胞和肝癌HepG2细胞的IC50值Table 2 The IC50s of the crude extracts from the endophytic fungi inN. tabacumto Caki-1 and HepG2 cell lines μg/mL

图2菌株TE-6L形态特征：(A)CYA平板；(B)MEA平板；(C)YES平板；(D-F)镰刀状分生孢子及有隔菌丝Fig. 2 Morphological characteristics of the fungal strain TE-6L. Colonies on agar media (A) CYA; (B) MEA; (C) YES; (D-F) Conidiophores and septahypha. Bar, 100 μm.

3 讨 论

烟草中蕴含着丰富的内生真菌资源，同时，也有部分烟草内生细菌的报道，如彭细桥等[34]筛选获得了对烟草青枯菌有拮抗作用的烟草内生细菌；雷丽萍等[35]发现烟草内生细菌具有还原硝酸盐和亚硝酸盐的能力。本研究通过对烟草内生真菌的分离和鉴定，发现烟草内生真菌的分布具有一定的组织偏好性，原因可能与根、茎、叶所处生态位不同有关。已有文献证明，环境及生态因素是内生真菌分布差异的主要原因。李文君[36]发现烟草不同生长时期、不同部位及不同海拔样地对烟草内生真菌的丰富度和多样性均有影响。由于环境因素对内生真菌的分布具有重要影响，因此不同产区烟草内生真菌可能的地域专化性值得进一步探究。

植物内生真菌是一类活性代谢产物丰富、应用广泛的潜在资源，目前已从青蒿[17]、水仙[29]、喜树[37]、雷公藤[38]等分离筛选出了具有抗肿瘤活性的内生真菌，为新型抗肿瘤先导药物的发现提供了新的途径。烟草作为一种历史悠久的药用植物，其内生真菌抗肿瘤活性的研究尚未见报道。本研究首次对烟草内生真菌的代谢产物进行了细胞毒活性测试，为开发新型抗肿瘤药物奠定基础。

4 结 论

本研究从皖南采集的栽培种烟草分离得到内生真菌62株，鉴定为4目7科9属，其中茎点霉属Phomasp.和镰刀菌属Fusariumsp.为优势属。总结了烟草内生真菌在烟草不同组织中的分布规律及菌群变化，其种类和数量分布存在组织偏好性和组织专化性，叶部内生真菌的分离率最高，其次为茎，根部最少。发现了一株具有潜在应用价值的菌株F. sambucinumTE-6L，其PDB发酵液及大米发酵物对Caki-1细胞48 h内IC50分别为13.28和0.36 μg/mL。烟草中蕴含丰富的具有细胞毒活性的内生真菌资源，为进一步寻找抗肿瘤活性物质新来源、开发新型抗肿瘤药物提供了新的途径。

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The Biodiversity of Endophytic Fungi in NicotianaTabacum and Their Cytotoxicity

LI Panpan1,2, YUAN Xiaolong1, ZHENG Xuan1,2, GAO Lin1, LIU Xinmin1, ZHANG Zhongfeng1, ZHANG Peng1, SHEN Guoming1*
(1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China)

To investigate the biodiversity, distribution, and the microbial community structure of the endophytic fungi inNicotiana tabacum, the endophytic fungi in different cultispecies were systematically isolated and identified. The preliminary screening of the cytotoxic activities was also performed. As a result, a total of 62 strains of the endophytic fungi were isolated and purified from the healthy tissues (roots, stems, and leaves) of tobacco using the tissue isolation method. The isolated strains were identified to belong to 4 orders, 7 families, and 9 genera based on their morphological and molecular characteristics. More species and strains were isolated from the leaves, followed by the stems, and those in the roots were the least. The cytotoxicity of the crude extracts was determined by CCK-8 assay. The results indicated that most of the strains were found to have some inhibitory activities on Caki-1 and HepG2 cell lines. The IC50s of the strain TE-6L to Caki-1 at 24 h and 48 h were 13.28 and 0.36 μg/mL, respectively. Combined with morphological characteristics and molecular analysis, this strain was identified asFusarium sambucinum. The results from this study indicated that the tobacco possess abundant endophytic fungi, which provides a new path for searching for novel antitumor resources.

tobacco; endophytic fungi; community distribution; secondary metabolites; cytotoxicity

S476.12

1007-5119（2017）03-0074-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.03.013

中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-TRIC05）；中国农业科学院烟草研究所青年科学基金项目“野生烟草Nicotianaalata化学成分多样性及抗植物病原菌活性研究”（2016A02）

李盼盼（1990-），女，在读硕士研究生，主要研究方向为植物内生真菌及其活性。E-mail：931449115@qq.com

*通信作者，E-mail：shenguoming@caas.cn

2016-09-12

2016-12-30