卢岩，田梦，沈庆思，张晶，孙振高，张永臣，贾红玲



隔药灸脐对卵巢早衰模型大鼠Bcl-2、Bax蛋白和mRNA表达的影响

卢岩1，田梦1，沈庆思1，张晶1，孙振高2，张永臣1，贾红玲2

1.山东中医药大学针灸推拿学院，山东济南 250355； 2.山东中医药大学附属医院，山东济南 250014

目的 观察隔药灸脐对卵巢早衰模型大鼠Bcl-2和Bax表达的影响，探讨其对卵巢的保护机制。方法 采用腹腔注射环磷酰胺建立大鼠卵巢早衰模型。48只雌性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸脐组、西药组，每组12只。隔药灸脐组大鼠隔药灸“神阙”，30 min/d，隔日1次，连续14 d；西药组大鼠予戊酸雌二醇灌胃，每日1次，连续14 d。采用免疫组化、Western blot和实时荧光定量PCR检测大鼠卵巢凋亡相关因子Bcl-2、Bax蛋白和mRNA的表达。结果 模型组大鼠卵巢质量明显低于正常组（＜0.05）。Bcl-2、Bax蛋白主要表达在细胞胞浆中，隔药灸脐组和西药组较模型组卵泡颗粒细胞Bax表达范围明显缩小，Bcl-2表达范围明显增加。与正常组比较，模型组大鼠卵巢Bcl-2蛋白和mRNA表达明显降低（＜0.05，＜0.01），Bax蛋白和mRNA表达显著升高（＜0.05，＜0.01）；与模型组比较，隔药灸脐组和西药组大鼠卵巢Bcl-2蛋白和mRNA表达显著升高（＜0.05，＜0.01），Bax蛋白和mRNA表达明显降低（＜0.05，＜0.01）。结论 隔药灸脐可能通过上调卵巢早衰模型大鼠卵巢Bcl-2和下调Bax的表达，改善卵巢功能。

卵巢早衰；隔药灸脐；神阙；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；大鼠

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40岁前出现持续性闭经、性器官萎缩、高卵泡刺激素、黄体生成素水平及低雌激素水平等围绝经期症状。流行病学研究显示，POF发病率在30岁前约为1/1000[1]，40岁前约为1%～3.6%[2]，发病率呈逐年上升趋势。隔药灸脐法综合艾灸、药物、穴位三者的优势，能激发、调动和增强机体自身的调节系统，可促进子宫、卵巢的血液循环，从而促进卵泡的发育和成熟。卵巢颗粒细胞在卵泡发育过程中起关键作用，颗粒细胞功能的减退、凋亡可触发卵泡闭锁，是卵巢早衰的根本原因。Bax、Bcl-2为调节卵巢颗粒细胞的凋亡重要因子。Bcl-2蛋白能抑制细胞凋亡，促进卵泡生长、发育；Bax蛋白则促进细胞凋亡，使卵泡停止发育，发生闭锁[3-4]，导致卵巢早衰。本实验观察隔药灸脐对卵巢早衰大鼠卵巢组织Bcl-2、Bax蛋白和mRNA表达的影响，探讨其治疗机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Wistar雌性大鼠60只，2～3月龄，体质量180～220 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于室温22～26 ℃、相对湿度60%环境，通风良好，自然昼夜光线，适应性饲养5 d。

1.2 药物、试剂与仪器

注射用环磷酰胺（江苏盛迪医药有限公司），戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司广州分公司）；BCA蛋白定量检测试剂盒（武汉谷歌生物科技公司，G2026）；兔抗actin（武汉谷歌生物科技公司，GB13001-1），兔抗Bax（Abcam，ab32503），兔抗Bcl-2（CST，2870S）。Bead Ruptor 12多样品研磨珠均质仪（Omni公司），荧光定量PCR仪（ABI公司，7300），紫外分光光度计（上海现科仪器有限公司，752-P），电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C），扫描仪（EPSON公司，V300），灰度分析软件（Alpha Innotech公司，alphaEaseFC），图像分析软件（Adobe PhotoShop）。

1.3 分组和造模

60只雌性大鼠随机分为正常组12只和造模组48只。采用连续腹腔注射环磷酰胺建立卵巢早衰动物模型[5]，注射结束后，每日固定时间取大鼠阴道脱落细胞置于显微镜下观察动情周期变化。若出现动情周期紊乱、动情间期延长、动情期消失等则为造模成功[6]，剔除动情周期没有紊乱的大鼠，将造模成功的大鼠随机分为隔药灸脐组、西药组和模型组，最终每组12只大鼠纳入数据统计。

1.4 干预方法

大鼠“神阙”（CV8）选穴标准参照文献[7]。隔药灸脐组大鼠采用本实验室自制艾灸固定器仰卧位固定[8]，脐部去毛，常规消毒后将自制药膏（肉苁蓉、淫羊藿、不老草、肉桂、乳香、没药等组成）均匀涂抹大鼠“神阙”（CV8），用自制艾条固定器将艾条（直径约0.8 cm，长约11.0 cm）固定，置于距离涂抹药膏处约2 cm处施温和灸，按艾条燃烧情况进行调节，每根艾条燃烧将要结束无法固定时进行更换，每次灸30 min，隔日1次，治疗周期为14 d。西药组大鼠予戊酸雌二醇0.09 mg/（kg•d）灌胃，每日1次，治疗6 d，休息1 d，治疗周期为14 d。正常组和模型组不作任何治疗，仅做与隔药灸脐组和西药组同样的抓取、固定。实验结束后大鼠麻醉，仰卧位固定，取双侧卵巢称重。一部分卵巢置于多聚甲醛固定（8只/组），免疫组化检测卵巢Bcl-2和Bax蛋白表达；另一部分卵巢置于-80 ℃冰箱保存，用于Bcl-2、Bax蛋白和mRNA的检测。

1.5 卵巢质量和卵巢指数测定

卵巢称重，计算卵巢指数[卵巢湿重（mg）÷体质量（g）]。

1.6 免疫组化检测

采用免疫组化方法检测大鼠卵巢组织参与细胞凋亡调控相关因子Bcl-2和Bax的蛋白表达。多聚甲醛固定，切片包埋，按照试剂盒说明书进行操作，镜下观察Bcl-2和Bax的蛋白表达。

1.7 Western blot检测

大鼠卵巢组织分别提取蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白上样并电泳分离，转移至PVDF膜上，加入一抗，4 ℃孵育过夜，经TBST洗膜后加入二抗，室温孵育30 min，经化学发光、曝光、显影、定影，扫描胶片，Alpha软件处理系统分析目标条带的光密度值。

1.8 实时荧光定量PCR检测

大鼠卵巢组织充分研末后取上清液，依次加入三氯甲烷、异丙醇等提取RNA。取PCR管，加入含2 μg RNA作为模板反转录，反应条件42 ℃，保温60 min，结束后80 ℃保温5 min灭活反转录酶。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min，共循环40次。采用ΔΔCt法进行结果处理，以GAPDH为内参，计算Bcl-2和Bax mRNA相对表达量，以2-ΔΔCt表示。引物序列：R-Bcl-2-S（GGATCCAGGATAACGGAGGC）、R-Bcl-2-A（ATG CACCCAGAGTGATGCAG）；扩增片段长度为141 bp；R-Bax-S（TGAACTGGACAACAACATGGAG）、R-Bax-A（AGCAAAGTAGAAAAG GGCAACC），扩增片段长度为148 bp；R-GAPDH-S（TTCCTACCCCCAATGTA TCCG），R-GAPDH-A（CATGAGGTCCACCACCCT GTT），扩增片段长度为281 bp。

1.9 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以±表示，多组间比较采用方差分析，方差齐用法，方差不齐用Dunnett' T3法。＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 隔药灸脐对卵巢早衰大鼠一般状况的影响

正常组大鼠毛发光亮柔顺，活泼好动，反应灵敏；模型组大鼠毛发枯槁竖立，狂躁不安，易激惹；隔药灸脐组和西药组大鼠一般情况较模型组有所好转，毛色恢复光泽，精神较好，反应较为灵敏；隔药灸脐组大鼠治疗后行为情况更接近正常组，尤其在施灸过程中，大鼠情绪安定，无烦躁不安症状，呈现假寐状态。

2.2 隔药灸脐对卵巢早衰大鼠卵巢质量和卵巢指数的影响

与正常组比较，模型组大鼠卵巢质量显著降低（＜0.05）；与模型组比较，隔药灸脐组、西药组卵巢质量增加，但差异无统计学意义（＞0.05）。模型组大鼠卵巢指数低于正常组，西药组、隔药灸脐组较模型组卵巢指数增加（＞0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠卵巢质量和卵巢指数比较（±s）

注：与正常组比较，#＜0.05

2.3 隔药灸脐对卵巢早衰大鼠卵巢组织Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织Bcl-2蛋白表达明显降低（＜0.05），Bax蛋白表达明显升高（＜0.05），Bcl-2/Bax比值明显降低（＜0.05）；与模型组比较，隔药灸脐组和西药组大鼠卵巢组织Bcl-2蛋白表达明显升高（＜0.05），Bax蛋白表达明显降低（＜0.05），Bcl-2/Bax比值明显升高（＜0.05）。结果见表2、图1。

表2 各组大鼠卵巢组织Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，#＜0.05；与模型组比较，*＜0.05

Bcl-2和Bax蛋白在各组大鼠卵巢组织均有表达，主要在细胞胞浆中，以棕色着色为主。正常组大鼠Bcl-2在各级卵泡颗粒细胞及黄体细胞中均有表达，模型组Bcl-2在卵泡颗粒细胞仅散在表达，隔药灸脐组和西药组Bcl-2表达范围明显大于模型组，见图2。正常组大鼠Bax表达见于黄体细胞，卵泡颗粒细胞仅见散在表达；模型组Bax主要表达于颗粒细胞的细胞质，在闭锁卵泡、生长卵泡及窦状卵泡中表达较明显；隔药灸脐组和西药组卵泡颗粒细胞Bax表达范围明显小于模型组，见图3。

2.4 隔药灸脐对卵巢早衰大鼠卵巢组织Bcl-2和Bax mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织Bcl-2 mRNA表达显著降低、Bax mRNA表达显著升高（＜0.01）；与模型组比较，西药组和隔药灸脐组大鼠卵巢组织Bcl-2 mRNA表达均显著升高，Bax mRNA表达均显著降低，Bcl-2/Bax比值均显著升高（＜0.01）。结果见表3。

正常组模型组 隔药灸脐组西药组

正常组模型组 隔药灸脐组西药组

表3 各组大鼠卵巢组织Bcl-2和Bax mRNA表达比较（±）

组别只数 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax 正常组41.050±0.3490.410±0.1032.727±1.046 模型组40.259±0.083##1.718±0.486##0.167±0.088## 隔药灸脐组41.114±0.274**0.516±0.174**2.336±0.854** 西药组41.233±0.255**0.610±0.086**2.040±0.432**

注：与正常组比较，##＜0.01；与模型组比较，**＜0.01

3 讨论

根据卵巢早衰的临床症状，可将其归于中医学“血枯”“闭经”“血隔”等范畴。《素问•上古天真论篇》曰：“女子七岁，肾气盛，齿更发长；二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子……七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。”系统阐述了肾气通过天癸而促进生殖之精的形成，从而维持生殖机能。肾气盛则天癸至，肾气衰则天癸竭。月经的产生不仅关乎肾气是否充足，还与冲任二脉的盛衰有关。正如《灵枢•五音五味》：“冲脉、任脉皆起于胞中。”《太平圣惠方•卷一》云：“夫任者妊也，此是人之生养之本。”“血海”之冲脉与“阴脉之海”之任脉与天癸关系密切。

隔药灸脐法综合了穴位、药物和艾灸的共同作用，能够激发、调动和增强机体的组织能力，从而促进卵泡的发育和成熟。吴亦鼎《神灸经论》提出：“夫灸取于人，以火性热而至速，体柔而用刚，能消阴翳，走而不守，善入脏腑，取艾之辛香作炷，能通十二经，入三阴，理气血，以治百病，效如反掌。”艾灸施于神阙能够激发经气、调动经脉，使气血和合、阴阳互补互长，兴奋下丘脑-垂体-性腺系统，改善微循环[9]，防治POF。隔药灸脐组方中所用肉苁蓉、淫羊藿、不老草、肉桂能温补肾阳，《神农本草经》记载：肉苁蓉主五劳七伤，补中……养五脏，强阴，益精气，多子……淫羊藿滋益精血，温补肝肾，清风明目，益志宁神。不老草活血气，封填骨髓，滋肾水，补益真阴之效。”有研究表明，温肾阳中药具有类雌激素的作用，能够调节下丘脑-垂体-卵巢轴，从而促进卵泡和子宫发育[10]。《遵生八笺》在描述人体气机运行时有“气气归脐”的说法，脐为先天结蒂、后天气舍，其穴神阙属任脉，任脉为“阴经之海”，与“阳经之海”的督脉相通；十二经之海的冲脉与任脉会于脐下；另外，足阳明胃经挟脐，足太阴之筋结于脐，手少阴之筋下系于脐，故神阙可谓一穴而系全身，为元阴元阳系结的部位。因此，隔药灸脐能够和阴阳、行气血、调冲任。本实验结果显示，大鼠注射环磷酰胺造模后毛发枯槁竖立、狂躁不安、易激惹；隔药灸脐组和西药组大鼠精神状况较模型组好转，毛色恢复光泽，反应较灵敏；隔药灸脐组大鼠治疗后与西药组比较，大鼠行为情况更接近正常组，尤其在施灸过程中，大鼠情绪安定，无烦躁不安症状，呈现假寐状态，表明隔药灸脐能改善POF引起的一系列临床表现，发挥其无毒副作用的优势，提高大鼠的生存质量。

环磷酰胺是常用的化疗药物，因有毒副作用，能干扰DNA正常代谢，尤其对卵巢、骨髓等分裂增殖活跃的组织影响明显[11]，常被用于制备POF大鼠模型。本研究结果亦表明，环磷酰胺腹腔注射后，与正常组比较，模型组大鼠卵巢质量显著降低。有研究表明，POF的发病机制是由于卵母细胞过快耗竭所致，卵母细胞的活化及持续生长发育依赖于其周围的颗粒细胞的营养及旁分泌作用[12]。卵巢颗粒细胞凋亡可导致卵泡闭锁，是POF的根本原因。

Bcl-2和Bax是颗粒细胞凋亡过程中重要的因子，通过形成异二聚体Bcl-2/Bax、同二聚体Bcl-2/Bcl-2或Bax/Bax 的形式影响细胞凋亡。Bcl-2与Bax互为拮抗作用，当体内Bax蛋白表达升高，Bax/Bax同二聚体形成增多，Bcl-2的活性下降，从而加速细胞凋亡[13-14]。反之，如果Bcl-2蛋白水平升高，则Bcl-2/Bax异二聚体形成增多，细胞凋亡则被抑制[15]。受凋亡刺激后细胞的生存能力由Bcl-2与Bax比值决定[16-17]。若Bcl-2表达水平升高、比值上调，抑制细胞凋亡；Bax表达水平升高、比值下调，促进细胞凋亡。

本研究结果表明，Bcl-2与Bax蛋白在各组大鼠卵巢组织中均有表达，大多在卵巢颗粒细胞胞浆中，多以棕色、深棕色着色为主。正常组大鼠Bax表达多见于黄体细胞，卵泡颗粒细胞仅见散在Bax表达；模型组Bax主要表达于颗粒细胞的细胞质，在闭锁卵泡、生长卵泡及窦状卵泡中表达较明显；隔药灸脐组和西药组卵泡颗粒细胞Bax表达范围明显小于模型组。正常组大鼠Bcl-2在各级卵泡颗粒细胞及黄体细胞中表达量均多，模型组Bcl-2在卵泡颗粒细胞仅散在表达，隔药灸脐组和西药组Bcl-2表达范围明显大于模型组。与正常组比较，模型组大鼠Bcl-2蛋白和mRNA表达明显降低，Bax蛋白和mRNA表达显著升高，Bcl-2/Bax蛋白和mRNA表达比值明显降低，表明环磷酰胺所致的大鼠POF与大鼠卵巢组织Bcl-2、Bax因子含量的变化密切相关。经治疗后，隔药灸脐和西药组大鼠卵巢组织Bcl-2蛋白和mRNA的表达水平显著升高，Bax蛋白和mRNA的表达水平显著降低，Bcl-2/Bax蛋白和mRNA表达比值显著高于模型组，提示隔药灸脐可以通过上调Bcl-2、下调Bax水平，改变Bcl-2/Bax比值，促进卵巢颗粒细胞分裂、抑制其过度凋亡，减少卵泡闭锁、抑制其凋亡，改善卵巢功能，促进POF的逆转。

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Effects of Herb-partition Moxibustion at Navel on Protein and mRNA Expressions of Bcl-2 and Bax in Rats Model with Premature Ovarian Failure

LU Yan1, TIAN Meng1, SHEN Qing-si1, ZHANG Jing1, SUN Zhen-gao2, ZHANG Yong-chen1, JIA Hong-ling2

Objective To observe the effects of herb-partition moxibustion at navel on the expressions of Bcl-2 and Bax in rats with premature ovarian failure (POF); To explore its mechanism underlying improvement of POF. Methods POF model was established by intraperitoneal injection of cyclophosphamide. Forty-eight Female Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, moxibustion group and Western medicine group, with 12 rats in each group. Rats of moxibustion group were treated with herb-partition moxibustion at navel (Shenque, CV8), 30 min/d, once every other day; rats of Western medicine group were given intragastric dose of estradiol valerate, once a day, for 14 d. The protein and mRNA expressions of Bax and Bcl-2 in ovarian granulosa cells were detected by immunohistochemal method, Western blot and qRT-PCR, respectively. Results The weights of ovaries in the model group rats were significantly lower than those in the normal group (<0.05). The expressions of Bcl-2 and Bax protein in ovarian tissue of each group were mainly expressed brown coloration and in the cytoplasm of cells. The range of Bax protein in granulosa cells of moxibustion group and Western medicine group was significantly less than that in model group. The range of Bcl-2 in moxibustion group and Western medicine group was significantly larger than that in model group. Compared with the normal group, the expressions of Bcl-2 protein and mRNA in the model group rats significantly decreased (<0.05,<0.01), and the expression of Bax protein and mRNA significantly increased (<0.05,<0.01). The expression level of Bcl-2 protein and mRNA was significantly higher in the moxibustion group and in the western medicine group than that in the model group (<0.05,<0.01). The expression level of Bax protein and mRNA in the moxibustion group was significantly lower than that in the model group (<0.05,<0.01). Conclusion The herb-partition moxibustion at navel can improve the function of ovaries by up regulating the expression of Bcl-2 and down regulating the expression of Bax in POF rats model.

premature ovarian failure; herb-partition moxibustion at navel; Shenque (CV8); Bcl-2; Bax; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.010

R245

A

1005-5304(2017)07-0040-05

国家自然科学基金（81373676）；山东中医药大学横向项目(730032)

贾红玲，E-mail：zhangyc58@sina.com

（2016-11-25）

（2017-01-24；编辑：华强）