田会玲，李小黎，唐启盛，李侠，李庆盟，高誉珊，张雯，孙新月，邵珺



颐脑解郁复方对卒中后抑郁大鼠行为学及海马CA1区病理损伤的影响

田会玲1，李小黎1，唐启盛1，李侠1，李庆盟1，高誉珊2，张雯1，孙新月1，邵珺1

1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029； 2.北京中医药大学中医学院，北京 100029

目的 探讨颐脑解郁复方对脑卒中后抑郁（PSD）大鼠行为学和海马CA1区病理损伤的干预作用。方法 将168只SPF级SD大鼠随机分为正常组、假手术组、卒中组、PSD组、西药组和中药组，正常组、假手术组各24只，其余组各30只。正常组不干预，假手术组不插入线栓，卒中组仅行大脑中动脉阻塞手术，PSD组、西药组、中药组卒中术后1周应用慢性束缚应激1周复合单笼饲养法制备PSD模型。造模开始时，西药组灌胃盐酸氟西汀，中药组灌胃颐脑解郁复方，其余各组灌胃蒸馏水，每日1次。第2、4、8周末，各组大鼠进行旷场试验等行为学测试，HE染色观察海马CA1区病理变化。结果 除第2周外，同一时间点中药组大鼠各项行为学评分均高于PSD组。同一时间点中药组大鼠海马CA1区较PSD组结构完整，细胞排列整齐，形态正常。结论 颐脑解郁复方可改善大鼠PSD症状，并对海马CA1区具有保护作用。

颐脑解郁复方；卒中后抑郁；行为学；海马CA1区；大鼠

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是临床脑卒中后常见并发症，主要表现为情绪低落、思维迟滞、兴趣减退及社会角色的紊乱等。我国每年大约有160万～200万新发脑卒中患者，约1/3存活患者发生PSD[1-2]。颐脑解郁复方是本课题组自行研制治疗PSD的中药复方，具有益肾疏肝、活血化瘀的功效，前期临床研究显示疗效显著[3]。本实验建立一种高度模拟临床PSD的大鼠模型，以探讨颐脑解郁复方对PSD大鼠行为学及海马CA1区的干预作用。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级健康雄性SD大鼠168只，2月龄，体质量（300±20）g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于室温（20±2）℃、相对湿度50%～60%环境，光照明暗交替12 h/12 h，自由摄食饮水。

1.2 药物及制备

颐脑解郁复方，北京中医药大学第三附属医院提供，依据前期研究[4]确定灌胃剂量为9.92 g/（kg•d），按照灌胃剂量煎药浓缩，浓度为0.62 g原药材/mL，4 ℃冰箱保存备用，用前加热；盐酸氟西汀胶囊，礼来（苏州）制药公司，批号0943A，临用时溶于蒸馏水，浓度为0.233 g/L，按照成人用量7倍计算大鼠用量为2.33 mg/（kg•d）。

1.3 主要试剂与仪器

戊巴比妥钠（美国Sigma公司，货号P3761-5），磷酸盐缓冲液（粉剂，福州迈新生物技术开发有限公司，货号PBS-0060），尼龙栓线（北京沙东生物技术有限公司，货号2838-A4），苏木素染色液（北京益利精细化学品有限公司，编号201506251323），水溶性伊红染色液（北京益利精细化学品有限公司，编号YZB/京0102-2011），返蓝染色液（北京益利精细化学品有限公司，编号2015032514324659）。旷场试验用敞箱（自制），强迫游泳试验用水箱（自制），自动化智能型正置研究级显微镜（奥林巴斯有限公司，型号BX53）。

2 实验方法

2.1 分组

大鼠实验前适应性饲养1周，采用随机数字法分为正常组24只、假手术组24只、卒中组30只、PSD组30只、西药组30只、中药组30只。正常组不干预，假手术组不插入线栓，卒中组仅进行卒中手术，PSD组、西药组和中药组均在卒中手术后1周进行PSD模型制备。自造模开始至实验结束，西药组和中药组大鼠分别灌胃氟西汀、颐脑解郁复方药液，其余各组每日灌胃等量蒸馏水。根据大鼠体质量计算氟西汀、颐脑解郁复方药液每日灌胃量，自脑卒中造模开始至实验结束，每次约3～4 mL，每日1次。

2.2 造模

参考新式线栓法[5]，制备大脑中动脉阻塞的脑卒中模型，缺血2 h后进行再灌注。入组标准：大鼠于缺血2 h后出现对侧前肢蜷曲、行走转圈或行走向对侧倒体征则纳入，无此体征或于2 h后仍不清醒者弃去。待脑卒中大鼠造模成功1周后，大鼠神经功能恢复后，将群养的PSD组、西药组、中药组大鼠分开单笼饲养至实验结束。孤养同时，每日10:00～16:00期间任取时间，将大鼠限制在特制的T型束缚台[6]（自制）上予2 h的行为限制，连续7 d。

2.3 观测方法

2.3.1 旷场试验 第2、4、8周末对各组大鼠进行旷场试验。将大鼠置于敞箱中心方格内，观察大鼠3 min内水平穿越格数（记为水平运动得分）、后肢直立次数（记为垂直运动得分）。

2.3.2 强迫游泳试验 第2、4、8周末对各组大鼠进行强迫游泳试验。大鼠禁食21 h，水箱内水深25 cm、水温（25±1）℃，连续观察5 min，记录大鼠在水中强迫游泳时间。

2.3.3 糖水偏爱试验 第2、4、8周末对各组大鼠进行糖水偏爱试验。大鼠禁食禁水20 h后，同时给予每只大鼠事先定量好的1瓶1%糖水和1瓶纯水。30 min后调换糖水和纯水的位置，60 min后取走2瓶并称量，计算大鼠糖水消耗比例。糖水偏爱度＝糖水消耗量÷总液体消耗量。

2.3.4 病理观察 第2、4、8周末大鼠行为学测试后，各时点大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（0.5 mL/100 g）麻醉，开胸暴露心脏，0.9%氯化钠溶液快速灌注，再用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定，断头取脑，4%多聚甲醛溶液内室温固定36 h，石蜡包埋后做冠状切片，HE染色，光镜下观察海马CA1区结构变化。

3 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据以±表示，组间比较采用方差分析，方差不齐用Welch法分析，两两比较用法。＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 旷场试验结果

在2、4、8周时，同一时点PSD组大鼠与卒中组比较水平运动得分均降低，4周时差异有统计学意义（＜0.05），垂直运动得分较卒中组均降低，4、8周时差异有统计学意义（＜0.05）；西药组大鼠与PSD组比较，同一时点水平运动得分均增加，2、8周时差异有统计学意义（＜0.01），垂直运动得分均增加，8周时差异有统计学意义（＜0.01）；同一时点中药组大鼠水平运动得分与PSD组比较均增加，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）；同一时点中药组大鼠垂直运动得分较PSD组均增加，4、8周时差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）；中药组与西药组比较，2、4、8周时大鼠水平、垂直运动得分差异均无统计学意义（＞0.05）。结果见表1。

4.2 强迫游泳试验结果

在2、4、8周时，同一时点PSD组大鼠与卒中组比较强迫游泳时间均减少，2、4周时差异有统计学意义（＜0.05）；与PSD组比较，同一时点西药组大鼠强迫游泳时间均增加，4、8周时差异有统计学意义（＜0.01）；中药组大鼠与PSD组比较，同一时点强迫游泳时间均增加，4、8周时差异有统计学意义（＜0.01）；中药组大鼠与西药组比较，2、4、8周时强迫游泳时间差异均无统计学意义（＞0.05）。结果见表2。

4.3 糖水偏爱试验结果

PSD组大鼠与卒中组比较，同一时点糖水偏爱度均降低，4、8周时差异有统计学意义（＜0.01）；西药组大鼠与PSD组比较，同一时点糖水偏爱度均升高，4、8周时差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）；中药组大鼠与PSD组比较，同一时点糖水偏爱度均升高，4、8周时差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）；中药组大鼠与西药组比较，糖水偏爱度2、4、8周时差异均无统计学意义（＞0.05）。结果见表3。

表1 各组大鼠不同时点旷场试验得分比较（±s，分）

注：与正常组比较，▲＜0.05，▲▲＜0.01；与假手术组比较，△＜0.05，△△＜0.01；与卒中组比较，#＜0.05，##＜0.01；与PSD组比较， □＜0.05，□□＜0.01（下同）

表2 各组大鼠不同时点强迫游泳时间比较（±s，s）

表3 各组大鼠不同时点糖水偏爱度比较（±s）

4.4 大鼠海马CA1区病理观察结果

2周时，正常组和假手术组大鼠海马CA1区结构完整，有3～4层细胞，排列紧密，呈圆形或椭圆形，细胞核、核仁清晰；卒中组大鼠海马CA1区结构尚完整，细胞较假手术组排列疏松，有2～3层细胞，细胞染色加深、核固缩，核仁不明显；PSD组大鼠海马CA1区有2～3层细胞，较卒中组更加疏松，细胞染色深、核固缩，核仁不明显，形态不规则，部分细胞呈空泡状；西药组和中药组大鼠海马CA1区结构完整，有3～4层正常细胞，排列紧密，核仁清晰，有少量细胞出现深染现象（见图1）。4周时，正常组和假手术组大鼠海马CA1区与2周时比较改变不明显；卒中组大鼠海马CA1区结构尚完整，有1～2层细胞，较正常组排列疏松，细胞染色加深、核固缩，核仁不明显；PSD组大鼠海马CA1区结构不完整，有1～2层细胞，较卒中组受损加重，大量细胞呈空泡状；西药组和中药组大鼠海马CA1区结构完整，有2～3层正常细胞，排列较紧密，有少量细胞出现深染现象，正常细胞周围出现浅粉色结构（见图2）。8周时，正常组和假手术组大鼠海马CA1区与4周时比较变化不明显；卒中组大鼠海马CA1区结构不完整，有1～2层细胞，染色深、核固缩，核仁不明显；PSD组大鼠海马CA1区结构不完整，细胞量少，多呈空泡状；西药组和中药组大鼠海马CA1区结构完整，有1～2层正常细胞，排列较紧密，细胞呈圆形或椭圆形，核仁清晰，深染细胞较少（见图3）。

正常组假手术组 卒中组PSD组 西药组中药组

正常组假手术组 卒中组PSD组 西药组中药组

正常组假手术组 卒中组PSD组 西药组中药组

5 讨论

本实验在脑缺血模型基础上应用慢性束缚应激复合单笼饲养方法制备PSD大鼠模型，观察颐脑解郁复方对PSD大鼠行为学及海马CA1区的干预作用。实验中采用线栓法制备脑卒中模型，在充分考虑大鼠脑卒中病理基础上，选用刺激温和、量小的慢性束缚应激结合孤养的方法制备PSD大鼠模型。该模型既有脑缺血卒中和抑郁发病的病理基础，又有卒中后肢体活动受限、离开亲友等情志刺激因素，模拟了PSD发生的生物学和心理学因素[7]，操作较简单，造模成功率高，是理想的PSD大鼠模型。行为学测试结果显示，4周时可成功建立PSD大鼠模型。

海马与人类的学习及情感等认知功能密切相关，是介导应激反应的最重要的脑区之一。研究表明，PSD大鼠存在脑卒中损伤侧海马神经再生障碍，而海马神经细胞凋亡会引发一系列抑郁症状[8]。本实验观察了大鼠缺血侧海马CA1区病理变化，发现PSD组大鼠海马CA1区较卒中组受损严重，应用药物干预的西药组与中药组大鼠海马CA1区受损情况明显减轻，提示PSD加重卒中后海马CA1区受损情况，而中药颐脑解郁复方可改善海马CA1区受损情况，保护脑内神经细胞。

中医“脑髓”的现代生物学基础是脑内神经元和神经营养因子。肾主生髓，“补肾填髓”中药可减少神经元死亡，促进神经元存活与再生[9]。肝主疏泄，主藏血，具有调畅气机、调节血量的职能，脑的血供和营养依赖于肝所藏之血及肝的疏泄功能[10]。研究表明，舒肝活血中药复方能改善中风后抑郁状态[11]，并可保护脑内神经元，缓解细胞凋亡[12]。本课题组认为脑卒中多因肾虚髓海失充，元神失养致病，而后情志不遂，肝气失调，痰瘀互结，发生PSD。病位在肝肾二脏，肾虚为基础，又兼气、痰、瘀阻滞。故课题组选用补肾填精、疏肝活血中药，立颐脑解郁复方以益肾舒肝、活血化瘀、颐脑醒神。行为学及病理结果显示，颐脑解郁复方可改善大鼠PSD症状，减轻大鼠海马CA1区受损情况，保护海马CA1区细胞。

有研究表明，益肾舒肝中药复方可显著增强PSD大鼠脑内胶质纤维酸性蛋白、脑源性神经营养因子、碱性成纤维生长因子等表达[13]，参与调节PSD的多条信号通路[14-15]，但其防治机制是一个复杂的过程，目前研究尚未完全阐明。本实验从行为学和病理改变探讨颐脑解郁复方对PSD的干预作用，研究尚不深入，未来将在神经干细胞增殖分化及信号分子的变化方面加以探索。

[1] 韩琳,陈宁,何俐.抗抑郁药预防卒中后抑郁有效性的Meta分析[J].中国循证医学杂志,2015,15(10)：1153-1160.

[2] 白慧东,娄育红,杨国萍,等.逍遥散治疗脑卒中后抑郁疗效的Meta分析[J].中国中医药信息杂志,2010,17(9)：26-27,76.

[3] 裴清华,唐启盛,程远.益肾调气法治疗脑卒中后抑郁(血瘀型)临床研究[J].吉林中医药,2008,28(7)：487-488.

[4] 李侠,唐启盛,侯秀娟,等.脑卒中后抑郁模型大鼠脑单胺递质变化及中药颐脑解郁方的干预作用[J].中国临床康复,2006,10(47)：49-51.

[5] 范瑞娟,罗亚非,孙玉凤.新式线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的建立[J].中国民族民间医药,2014,31(6)：26-27.

[6] 陈家旭,李伟,赵歆,等.三种中药复方对慢性束缚应激大鼠皮层和海马BDNF、TrkB的影响[J].中国病理生理杂志,2007,23(7)：1296-1300.

[7] 谢伟坚.缺血性脑卒中后抑郁相关因素分析[J].中国医药导报,2011, 8(18)：67-68.

[8] HUANG X, MAO Y S, LI C, et al. Venlalaxine inhibits apoptosis of hippocampal neurons by up-regulating brain-derived neurotrophic factor in a rat depression model[J]. Pharmazie,2014,69：909-916.

[9] 李林,魏海峰,张兰,等.中医“肾生髓,脑为髓海”现代生物学基础探讨[J].中国中药杂志,2006,31(17)：1397-1400.

[10] 戎志斌,郭文鹏,姚乃礼.从肝论治脑病[J].中国中医药信息杂志, 2014,21(5)：114-116.

[11] 魏玖月,奚燕萍.卒中后抑郁症的中医治疗[J].中医临床研究,2013, 5(24)：109-111.

[12] 樊蔚虹,姚建平,赵文景.柴胡疏肝散对卒中后抑郁大鼠海马组织Bcl-2、Bax蛋白表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(3)：181-183.

[13] 唐启盛,司银楚,裴清华,等.颐脑解郁方对脑卒中后抑郁状态模型大鼠脑内GFAP、BDNF、bFGF的影响[J].北京中医药大学学报,2005,28(4)：32-35.

[14] 赵瑞珍,黄育玲,唐启盛,等.颐脑解郁方对脑出血后抑郁大鼠脑内PI-3K、Akt信号转导通路的影响[J].中医药学报,2008,36(6)：12-14.

[15] 唐启盛,赵瑞珍,李小黎,等.颐脑解郁方对抑郁大鼠脑内ERK通路的影响[J].中华中医药杂志,2012,27(3)：619-621.

Effects ofPrescription on the Behaviors and Damages of Pathology in Hippocampal CA1 Area of Rats with Post-stroke Depression

TIAN Hui-ling1, LI Xiao-li1, TANG Qi-sheng1, LI Xia1, LI Qing-meng1, GAO Yu-shan2, ZHANG Wen1, SUN Xin-yue1, Shao Jun1

Objective To investigate the intervention effects ofPrescription on the behaviors and damages in hippocampal CA1 area of the rats with post-stroke depression (PSD). Methods Totally 168 SPF male SD rats were randomly divided into normal group, sham-operation group, stroke group, PSD group, Western medicine group and TCM group. There were 24 rats in the normal group and sham-operation group, and 30 rats in the other groups. Rats in the normal group received no intervention. Rats in the sham-operation group received no suture. Rats in the stroke group were given middle cerebral artery occlusion operation and normally fed after operation. Rats in the PSD group, Western medicinal group and TCM group were made into PSD models by chronic immobilization stress for one week and individual battery to the end. At the inception of modeling, Western medicine group received fluoxetine hydrochloride for gavage; TCM group receivedPrescription for gavage; other groups received distilled water for gavage, once a day. At the end of week 2, 4, and 8, the morphology of the hippocampal CA1 area in each rat was observed by microscope after HE stained. Results Except for the week 2, at the same time point, the behavior scores of the rats in the TCM group were higher than those in the PSD group. At the same time point, the CA1 region of the hippocampus in the TCM group was more complete than the PSD group, and the cells were arranged neatly and in normal morphology. ConclusionPrescription can improve the symptoms of PSD rats, and has protective effects on hippocampal CA1 area.

Prescription; post-stroke depression; behaviors; hippocampal CA1 area; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.012

R285.5

A

1005-5304(2017)07-0049-05

国家自然科学基金（81673930）；北京市自然科学基金（7142100）

李小黎，E-mail：tigerlxl2002@163.com

（2016-10-30）

（2016-11-30；编辑：华强）