液相色谱串联质谱检测乳胶气球中的亚硝胺及可亚硝化物

2017-07-01刘丽丽刘晓慧张浛赫张汉民

世界橡胶工业 2017年5期

关键词：亚硝基亚硝胺质谱法

刘谦，刘丽丽，刘晓慧，张浛赫，王宇，颜红，张汉民

(保定出入境检验检疫局, 河北保定 071001)

液相色谱串联质谱检测乳胶气球中的亚硝胺及可亚硝化物

刘谦，刘丽丽，刘晓慧，张浛赫，王宇，颜红，张汉民

(保定出入境检验检疫局, 河北保定 071001)

参照EN71：12—2013，对气球中的13种挥发性亚硝胺及可亚硝化物进行了迁移提取、分离净化，并用液相色谱串联质谱法对其进行了定性和定量分析。气球中的N-亚硝胺及前体物检出限为0.05 mg/kg；回收率85.2%～113.6%，精密度3.23%～9.12%。运用该方法分析的气球样品中，N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基二正丁基胺（NDBA）及其前体物检出频率最高，占N-亚硝胺总迁移量的比例最大；N-甲基-N-亚硝胺苯胺（NMPhA）、N-亚硝基-二乙醇胺（NDELA）、N-亚硝基吗啉（NMOR）、N-亚硝基二丙胺（NDPA）、N-亚硝基哌啶（NPIP）、N-亚硝基-双-异丙基胺（NDiPA）、N-亚硝基二异丁胺（NDiBA）、N-亚硝基二异壬基胺（NDiNA）、N-亚硝基-N-乙基苯胺（NEPhA）、N-亚硝基二苄胺（NDBZA）及其前体物均未检出。该方法前处理过程简单，灵敏度高，适用于批量样品的快速分析。

N-亚硝胺；可亚硝化物；气球；液相色谱串联质谱

0 前言

N-亚硝胺是一类有—N—N=O结构的有机化合物，是目前已知最主要的强致癌物之一[1-8]。N-亚硝二甲胺（NDMA）和N-亚硝基二乙胺（NDEA）属于挥发性N-亚硝胺，具有一定的急性毒性、致癌性、致畸性和致突变性。亚硝胺广泛存在于土壤、橡胶制品、皮革、化妆品、烟草及腌制食品中，可通过呼吸道、消化道等途径进入人体[9-15]。食品、烟草、化妆品和橡胶制品等都可能存在N-亚硝胺的污染。橡胶制品中的N-亚硝胺主要来自以仲胺为基础的硫化促进剂和硫磺给予体，这些物质与空气或配合剂中的氮氧化物反应生成稳定的N-亚硝胺。

气球是一种常见的儿童橡胶玩具，在其加工过程中，硫化是最重要工艺之一，在高温硫化、最终成型过程中会使用到硫化剂和硫化促进剂，为此气球中检出N-亚硝胺屡见不鲜。荷兰学者分别于2002年7月和2004年7月对市场上气球样品中N-亚硝胺及其前体物的迁移量进行了普查，结果发现，NDMA、NDBA（N-亚硝基二正丁基胺）及其前体物在气球样品中被普遍检出。为此，德国政府将气球中N-亚硝胺及前体物的迁移限量设定为0.05 mg/kg和5 μg/dm2。2011年，幸苑娜等[4]用气相色谱串联质谱法对购自超市的气球样品进行检测，发现NDMA、NDEA 及NDBA均有检出。鉴于亚硝胺可对人体产生的毒害影响，欧盟指令EN 12868—1999明确规定在弹性体、橡胶奶嘴、安抚奶嘴中N-亚硝胺的迁移量不得超过10 μg/kg。2009年6月，欧盟新玩具指令2009/48/EC发布，欧盟统一禁用300多种亚硝胺类化合物，并于2013年6月首次发布了EN 71：12—2013《玩具安全-第12部分：N-亚硝胺和N-亚硝基化合物》标准，限定了供3岁以下儿童使用的弹性体材料制造的玩具（含气球）限量为0.05 mg/kg。我国对橡胶、弹性体材料中的N-亚硝胺也加以限制，规定其含量不得超过500 μg/ kg[16-20]。

面对美国和欧盟越来越严格的气球中亚硝胺的限量要求，建立合理、快速、准确的气球中N-亚硝胺及可亚硝化物含量的测定方法尤为重要。采用液相色谱串联质谱法对气球中13种亚硝胺及可亚硝化物进行了检测，并对检出情况进行深入分析。结果表明，该方法选择性强，灵敏度高，操作简便。

2 试验

2.1 仪器和设备

Waters 2695高效液相色谱仪、Waters TQD串联四极杆质谱仪（ESI源），美国Waters公司；梅特勒天平，瑞士梅特勤公司；PНS-3C精密рН计（上海雷磁公司）；SНA-B恒温水浴振荡器，常州国华电器公司。

2.2 试剂与材料

N-甲基-N-亚硝胺苯胺（NMPhA，纯度＞99.5%）、N-亚硝基-乙二醇胺（NDELA，97.7%）、N-亚硝基吗啉（NMOR，99.0%）、N-亚硝基二丙胺（NDPA，98.8%）、N-亚硝基-正二丁胺（NDBA，99.1%）、N-亚硝基哌啶（NPIP，99.2%）、N-亚硝基二乙胺（NDEA，99.5%）、N-亚硝基-双-异丙基胺（NDiPA，99.0%）、N-亚硝基二异丁胺（NDiBA，97.0%）、N-亚硝基二异壬基胺（NDiNA，96.0%）、N-亚硝基-N-乙基苯胺（NEPhA，97.0%）、N-亚硝基二苄胺（NDBZA，96.0%）、N-亚硝基二甲基胺（NDMA，99.5%），均购自德国Dr.公司；碳酸氢钠、氯化钠、碳酸钾、亚硝酸钠、盐酸、氢氧化钠，均为分析纯，购自天津科密欧化学试剂有限公司。

2.3 样品前处理

2.3.1 模拟唾液

参考EN 71：12—2013标准，将碳酸氢钠4.2 g、氯化钠0.5 g、碳酸钾0.2 g和亚硝胺30.0 mg溶于蒸馏水中，用蒸馏水稀释至900 mL,用0.1 mоl/L的盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节рН至9.0，转移至1 L容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度线。

2.3.2 N-亚硝胺处理过程

把气球纵向切成两半，获得近对称块；根据样品质量再纵向剪成两半，再次得到两个近对称块。称取3.5～4.5 g样品，于50 mL锥形瓶中加入10倍样品量的、预热至（40+2）℃的模拟唾液，确保样品完全浸入[必要时加入已预热至（40+2）℃的玻璃珠]，该浸泡液于（40+2）℃的水浴中浸泡（60+3）min。将测试液转移至50 mL具塞量筒中，该测试液用于N-亚硝胺的测试。

2.3.3 亚硝化处理过程

取2.3.1的测试液5 mL，于离心管中加入0.5 mL的1 mоl/L 盐酸溶液，盖紧混匀，于（40+2）℃水浴中保持（30+1）min；加入1.0 mL 的 1 mоl/L氢氧化钠溶液，混合均匀。该测试液即为可亚硝化的N-亚硝胺的测试液。

2.4 仪器分析

2.4.1 液相色谱条件

色谱柱：CNW C18，100 A，5 μm，长150 mm，内径2.1 mm；流动相：洗脱程序详见表1；柱温：35 ℃；进样量：20 µL。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

2.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；气帘气：50 L/h；雾化气：800 L/h；离子源温度：120 ℃。定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量详见表2。

表2 质谱参数

3 结果与讨论

3.1 样品前处理条件

本方法选择了EN 71：12—2013的前处理条件，这主要是因为该方法流程简单，节约时间和人力，可以同时检测大量样品，有机试剂的使用量小，减轻了对人体和环境的污染。

3.2 色谱条件的选择

3.2.1 流动相的选择

在液相色谱串联质谱的分析中，流动相的组成既影响目标化合物的色谱峰形和分离效果，又影响其离子化效率和质谱检测灵敏度。本方法比较了甲醇-水。乙腈-水对化合物在C18色谱柱上分离的效果。结果表明，在甲醇-水、乙腈-水体系中，13种化合物均能得到对称的峰形，考虑到在甲醇水体系中更容易形成[M+Н]+,本文选用甲醇-水作为流动相。为了进一步提高化合物的离子化效率，在纯水体系里分别添加了0.05%、0.1%、0.2%三个浓度的甲酸，结果发现，甲酸浓度不同对出峰的对称性和灵敏度都有影响。当流动相添加0.1%的甲酸时，峰形对称、信噪比高、灵敏度好，因此本方法最终选择甲醇-甲酸（0.1%）水溶液作流动相。

3.2.2 质谱条件的选择

13种N-亚硝胺类化合物均含有—N—N=O结构，在ESI+模式下均能够通过加合Н离子得到准分子离子峰。在确定待测化合物监测的母离子和子离子的基础上，对离子源温度、雾化气流量及温度、碰撞电压等条件进行优化。分别将13种化合物的标准品用初始流动相稀释成1 μg/mL的工作液，在ESI+的模式下对各分析物进行质谱优化，通过选择离子监测优化去簇电压，再通过优化碰撞能量对子离子进行全扫描，最终选择响应值最大、丰度最强、干扰最小的为子离子（表2）。

3.3 标准曲线及线性范围

在优化的色谱和质谱条件下，13种N-亚硝胺类化合物分别被配置成一系列不同浓度的标准溶液：0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 μg/mL，进行液相色谱串联质谱检测，以信噪比S/N=3 计算仪器检出限，其线性方程和相关系数详见表3。13种亚硝胺在线性范围为10～200 ng/mL之间线性关系良好，线性方程相关系数r2均大于等于0.990。检出限为0.05 mg/kg。

表3 13种亚硝胺的曲线线性方程及线性范围

3.4 回收率及精密度

按照2.3方法对未检出亚胺类物质的空白气球样品做13种亚硝胺的加标回收实验，添加水平分别为50、100、500 ng/mL，每组有6个平行样品，上机测试N-亚硝胺物质及其前体物的含量。通过计算得到目标物的回收率及相对标准偏差，结果详见表4。13种亚硝胺的回收率为85%～113%,相对标准偏差为3.23%～9.12%。

表4 13种亚硝胺的回收率和相对标准偏差RSD(n=6)

3.5 样品结果分析

3.5.1 气球中13种N-亚硝胺的平衡迁移量

根据文献[4,8]介绍，儿童接触气球的时间远远低于接触奶嘴的时间，EN 71：12—2013将模拟迁移时间由24 h改为1 h。为了确定气球制备时的温度和时间对气球中亚硝胺及可亚硝化物含量的影响，按表5的条件制作了照EN 71：12—2013的实验方法对气球做了模拟迁移实验，实验结果见表6。

表5 乳胶气球制备条件

从表6可以看出，所分析的16个样品中，NDMA的检出率最高，在12个样品中有检出，检出含量0.041 2～1.980 0 mg/kg；其次是NDEA，有10个样品检出，平衡迁移量0.025 4～1.590 0 mg/kg。NDBA的前体物检出也较多；在NDEA和NDMA的前体物同样有检出，且前体物迁移量高于NDEA和NDMA的迁移量，平衡迁移量分别为0.125～1.590 mg/kg和0.325～1.770 mg/kg；而NDBA在A5样品中有检出，但是其前体物未检出，在A7、A8、B7、B6、B8前体物有检出，但是亚胺类物质却未检出。其他10种亚胺类物质及前体物均未检出。这一现象在荷兰RIVM实验室的测试结果中也有体现。在本研究中，NDBA及前体物在样品中的检出频率不一致，如A5-1检出但A5-2未检出，造成这种现象的原因有待于进一步研究。

表6 气球中N-亚硝胺迁移量

（续前表）

3.5.2 温度和反应时间对亚胺类物质的影响

从表5和6的结果可以得出随着温度的升高，亚硝胺及可亚硝化物的含量会随之增加的结论。当温度低于40 ℃时，亚硝胺及可亚硝化物均没有检出；当温度高于40 ℃，NDMA、NAEA开始检出并随着温度的增高含量逐渐增加。

本文分别实验了制备时间为3.0和3.5 h对气球中N-亚硝胺和可亚硝化物含量的影响，结果表明，在相同温度下制备时间为3.5h的比3 h的气球中N-亚硝胺的含量及可亚硝化物的含量高。

4 结论

采用EN 71：12—2013 对气球中亚硝胺及可亚硝化物进行了检测，发现其前处理过程简便，检测灵敏度高。另外，气球生产过程中的反应时间和温度都对气球中的亚硝胺及可亚硝化物含量有一定影响：随着反应温度和反应时间的增加，气球中可亚硝化物和亚硝胺的含量都会增加。气球企业在生产过程中应该适当控制反应温度和时间，以减少亚硝胺的生成。

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