严红梅+阮琰+林伟+唐伟伟+熊丽君+黄明翔+翁丽珍

[摘要] 目的 用表面增強激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术和蛋白质芯片技术检测儿童支原体肺炎（MPP）和非MPP患者血清蛋白指纹图谱，探讨基于人工神经网络的的蛋白指纹图谱诊断模型对儿童MPP早期诊断的价值。方法 用SELDI-TOF-MS技术和蛋白质芯片技术测定2014年11月—2016年6月该院儿科住院的130例血清标本的蛋白指纹图谱，其中MPP 68例，非MPP 62例。将测定的血清蛋白指纹图谱建立人工神经网络预测模型，用随机抽取的75例标本（MPP 40例，非MPP 35例）作为训练组，进行训练与交叉验证，另外55例标本（MPP 28例，非MPP 27例）作为测试组，进行盲法验证该模型。结果 利用从75例训练组得出的基于人工神经网络的由M/Z为4 094.91、4 650.51、5 825.38、6 031.77、7 862.79、10 122.04组成的MPP血清蛋白指纹图谱决策树诊断模型，对MPP诊断的敏感性95.00%（38/40），特异性为88.57%（31/35），阳性率为92.00%（69/75），ROC曲线下面积为0.975，利用测试组的55例标本对模型进行验证，结果显示，对MPP诊断的敏感性89.29%（25/28），特异性为96.30%（26/27），阳性率为92.27%（51/55）。结论 该研究建立的支原体肺炎蛋白指纹图谱诊断模型对支原体肺炎的检测时间短，诊断准确率高，有助于诊断支原体肺炎。

[关键词] 蛋白指纹图谱技术；实验室诊断技术；儿童支原体肺炎

[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）05（a）-0004-05

[Abstract] Objective Enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry（SELDI-TOF-MS） with the purpose of detecting mycoplasma pneumonia in children and the technology of protein chip technology（MPP） and non MPP serum protein fingerprint， explore the early diagnosis of children MPP protein fingerprints of the artificial neural network diagnostic model based on the value of. Methods The protein fingerprints of 130 serum samples which be in pediatrics from Nov. 2014 to Jun. 2016 were determined by SELDI-TOF-MS and protein chip technique， including MPP 68 cases and non MPP 62 cases. The determination of serum protein fingerprint to establish artificial neural network prediction model， using 75 samples randomly selected （MPP 40 cases， MPP 35 cases） as the training group， training and cross validation， the other 55 specimens （MPP 28 cases， MPP 27 cases） as the test group， the blind method to verify the model. Results From 75 cases of training group based on the artificial neural network by M/Z was 4 094.91， 4 650.51， 5 825.38， 6 031.77， 7 862.79， 10 122.04 OMPP serum protein fingerprint decision tree diagnosis model， the sensitivity of 95.00% in diagnosis of MPP （38/40）， the specificity was 88.57% （31 /35）， the positive rate was 92.00% （69/75）， the area under the ROC curve was 0.975， verified the model by using 55 samples test Results showed that the sensitivity of 89.29% in diagnosis of MPP（25/28）， the specificity was 96.30% （26/27）， the positive rate was 92.27% （51/55）. Conclusion The diagnostic model of Mycoplasma pneumoniae protein fingerprint established in this study can be used for the diagnosis of Mycoplasma pneumonia.

[Key words] Protein fingerprinting technology； Laboratory diagnosis； Mycoplasma pneumonia in children

有研究显示病原体为肺炎支原体（Mycoplasma，MP）的支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP），在因社区获得性肺炎（Community acquired pneumonia，CAP）住院的儿童患者中所占比例可达10%～40%[1-2]。传统认为MPP大多数临床症状相对较轻，经大环内酯类抗生素治疗后症状可好转，且支原体感染多有自限性，预后良好。但是近几年，临床表现为难治性支原体肺炎（RMPP）及重症支原体肺炎（SMPP）的患者逐渐增多[3]。重症支原体肺炎（SMPP）容易出现胸腔积液、肺不张、坏死性肺炎、肺脓肿等严重并发症以及引起皮肤黏膜、泌尿系统、消化系统、心血管系统、中枢神经系统等功能的损害[4-5]，进而危及生命。目前临床最常应用的诊断肺炎支原体（MP）感染的检验方法为血清支原体特异性抗体检测，但是抗体在疾病发病早期的血清学检查结果可为阴性，而且在婴幼儿及免疫低下者，由于产生抗体的免疫应答反应相对低下，早期抗体滴度不高，均较容易出现漏诊。近年来，蛋白指纹图谱技术（protein fingerprinting technolo-gy，PFP）、表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术和蛋白质芯片技术已广泛应用于恶性肿瘤、肺结核、SARS、类风湿性关节炎等疾病的诊断，关于PFP应用于儿童MPP的研究国内鲜见报告。该研究方便选择2014年11月—2016年6月在该院儿科住院的儿童MPP、非MPP共130例患儿进行血清蛋白指纹图谱检测，寻找支原体肺炎的特异蛋白峰，建立儿童支原体肺炎的蛋白指纹图谱库，以提高支原体肺炎的早期诊断从而给予及时准确的治疗，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选择在该院儿科住院的肺炎患者130例，其中MPP患儿68例，非MPP患儿62例为研究对象。两组患儿均无其他呼吸道及肺部疾病。68例MPP，男32例，女36例，年龄1～14岁，平均（5.95±3.07）岁，病程3～180 d，平均（17.99±32.84）d，62例非MPP患儿，男35例，女27例，年龄7月～12岁，平均（5.25±2.97）岁，病程2～60 d，平均（14.85±15.29）d。两组患者的年龄、性别构成比、病程等一般资料具有可比性（P>0.05）。各组临床症状如表1。所有病例随机分成两组：训练组75例（MPP 40例，非MPP 35例），测试组55例（MPP 28例，非MPP 27例）。MPP组中，临床症状分别为67例咳嗽，54例（79.41%）发热，15例（22.06%）气喘，3例（4.41%）胸痛，1例咯血，非MPP组中，62例（100.00%）咳嗽，41例（66.13%）发热，27例（43.55%）气喘。排除标准：排除内分泌系统疾病患者，肝、肾、心功能不全患者，精神病史者，先天畸形患者。诊断标准：儿童肺炎及支原体肺炎诊断标准均参照第七版实用儿科学中儿童肺炎及支原体肺炎诊断标准[6]。

1.2 检测方法

1.2.1 主要仪器和试剂 型号为PBSⅡ/C的蛋白指纹图谱仪，弱阳离子交换型蛋白磁珠（WCX Magnetic Beads）。

1.2.2 血清标本的收集 患儿入院第2天清晨空腹抽取静脉全血2 mL，放于4℃冰箱中静置1～2 h，然后离心10 min（4℃，3 000 r/min），取出上层血清分装，保存于-80℃的冰箱。

1.2.3 检测步骤 ①血清样品的处理：取5 μL血清样品加入10 μL裂解液，室温下混合孵育30 min，加入185 μL PH为7.4的磷酸盐缓冲液稀释。②取50 μL的磁珠加入200 μL PCR Tube中，于室温下磁铁上孵育1 min，去除上清液；PCR Tube加入50 μL缓冲液洗脱5 min后，磁铁上孵育1 min后，去除上清液；PCR Tube再次加入100 μL缓冲液洗脱5 min，PCR Tube磁铁上孵育1 min，然后把PCR Tube加入100 μL血清样品（处理好的）。（3）加入血清样品的PCR Tube孵育30 min（室温），PCR Tube在室温下于磁铁上孵育1 min，去除上清液，PCR Tube加入100 μL缓冲液洗脱5 min；PCR Tube磁铁上孵育1 min，去除上清液，PCR Tube加入10 μL洗脱缓冲液洗脱5 min；PCR Tube磁铁上孵育1 min，取出上清液5 μL移至另一PCR Tube中，PCR Tube加入5 μL SPA（人葡萄球菌蛋白A）饱和溶液充分混匀，取1 μL混合溶液加样到全钢（Au/PCR TubeSteel）芯片上风干。

1.2.4 数据收集 芯片干燥以后，放入型号为PBSⅡ/C的质谱仪收集数据，用Proteinchip Sohware 3.2.1软件采集血清蛋白质谱表达谱。

1.3 肺炎支原体抗体检测

所有患儿入院第2天清晨空腹抽取静脉血2 mL，使用免疫荧光法检测肺炎支原体IgM，使用酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测肺炎支原体IgM及IgG的混合抗体，对肺炎支原体混合抗体为1：40或1：80的患儿1周后再次抽取静脉血检测抗体滴度。

1.4 统计方法

用BiomarkerWizard软件提取信噪比>5的蛋白峰做后续统计分析变量，用SPSS 16.0统计学软件对两组组计量数据进行独立样本t检验，用BPS 5.0软件对独立样本t检验分析结果P<0.01的蛋白峰建立诊断决策模型，并进行验证。用R0C曲线下面积评价诊断模型的正确性。

2 结果

2.1 支原体肺炎蛋白指纹图谱诊断模型的建立

对所有数据进行分析，发现P<0.01的蛋白峰共有33个，然后通过人工智能神经网络软件自主挑选出6个蛋白峰见表1，M/Z分别为4 094.91、4 650.51的2个蛋白峰在MPP组中高表达，M/Z分别为5 825.38、6 031.77、7 862.79、10 122.04的4个蛋白峰在MPP組中低表达。建立由这6个蛋白峰组成的决策树诊断模型，见图1。该诊断模型规则为当蛋白峰符合以下条件之一则为非MPP：①M4 650.51≤3.205 53且M4 094.91≤4.150 69，②M4 650.51>3.205 53且M6 031.77≤0.181 587且M7 862.79≤2.560 78且M5 825.38>1.810 7，③M4 650.1>3.205 53且M6 031.77>0.181 587且M6 031.77≤2.164 23且M10 122.00≤0.296 411且M7 862.79>1.840 15，④M4 650.51>3.205 53且M6 031.77>2.164 23，当蛋白峰符合以下条件之一则为MPP：①M4 650.51≤3.205 53且M4 094.91>4.150 69，②M4 650.51>3.205 53且M6 031.77≤0.1815 87且M7 862.79≤2.560 78 M5 825.38≤1.810 7，③M4 650.51>3.205 53且M6 031.77≤0.1815 87且M7 862.79>2.560 78，④M4 650.51>3.20 553且M6 031.77>0.181 587且M6 031.77≤2.164 23且M10 122.0≤0.296 411且M7 862.79≤1.840 15，⑤M4 650.51>3.205 53且M6 031.77>0.181 587且M6 031.77≤2.164 23且M10 122.0>0.296 411。用此模型诊断35例非MPP，31例正确，4例错误；诊断40例MPP，38例正确，2例错误，见表2。此诊断模型诊断支原体肺炎的敏感性95.00%（38/40），特异性为88.57%（31/35），阳性率为92.00%（69/75）。此决策树模型诊断非支原体肺炎的ROC值曲线下面积达0.975，见图2，诊断支原体肺炎ROC曲线下面积为0.975，见图3。M/Z为4650.51、7862.79的蛋白峰表达差异在MPP组和非MPP组的比较见图4。

2.2 支原体肺炎蛋白指纹图谱诊断模型的盲法验证

将测试组55例标本的血清蛋白质谱数据导入已建立的决策树诊断模型，其中非MPP 27例，MPP 28例。结果显示，27例非MPP样本中，26例诊断正确，1例诊断错误，28例MPP中，25例诊断正确，3例诊断错误，见表3。诊断模型的检测MPP的敏感性89.29%（25/28），特异性为96.30%（26/27），阳性率为92.27%（51/55）。盲法验证支原体肺炎的诊断模型，进一步分析验证了所建立模型的准确性及有效性。

3 讨论

儿童MPP临床表现轻重不一，病程长、病情复杂，大约1/4患儿可出现呼吸系统以外的并发症，重者可表现为坏死性肺炎、肺脓肿、Stevens-Johnson綜合征、心肌损害、脑膜炎、嗜血细胞综合征、肝功能损害，甚至有危及生命的风险[7-8]。因此，寻找一种简便、快速的支原体肺炎的诊断标志物，有着重要的临床意义。

人类基因组测序计划的完成，使得疾病的诊断可以通过对蛋白质的分析来完成。血液中可检测到的蛋白质>2 000种，通过对其进行分析，可反映出不同疾病不同阶段的病理改变[9-10]。蛋白指纹图谱技术（PFP），是通过蛋白指纹图谱仪利用激光脉冲辐射使芯池中的样品分子电离，检测不同的离子在电场中飞行的时间，从而可以测定离子的荷质比（M/Z），进而形成质谱。通过对图谱进行分析，可发现新的与各种疾病相关的特异性蛋白质。

随着蛋白质组学的发展和应用，病原体的研究从基因转向了蛋白质组学，已有报道进行相关研究的病原体有病毒、细菌、结核菌。王雅杰等[11]报道，应用PFP技术建立的SARS诊断模型，敏感性为97.30%，特异性为91.80%。黄文芳等[12]报道在分子量5～20 KD范围内不同种引起血流感染的细菌具有特征性蛋白指纹图谱，同种引起血流感染的细菌则具有相似的蛋白指纹图谱，主要蛋白峰分子量的变异系数小于0.1%。曾白华等[13]报道应用SELDI-TOF-MS技术建立的产ESBLs肺炎克雷伯菌蛋白质谱决策树诊断模型，灵敏度和特异度分别为93.33%、96.43%。王琳等[14]进行的研究显示，利用蛋白指纹图谱技术建立的诊断模型，诊断菌阴肺结核与肺炎的总有效率为84.20%，灵敏度为82.50%，特异度为85.90%。翁丽珍等[15]报道应用蛋白指纹图谱技术建立的诊断模型，诊断社区获得性细菌性肺炎的敏感度为100.00%，特异度92.30%，阳性率为95.80%。该研究建立的诊断模型诊断MPP的敏感性95.00%，特异性为88.57%，阳性率为92.00%，灵敏度及特异度均较高。

该研究对130例儿童肺炎患者进行支原体抗体检测，其中有59例在入院第2天抽血结果中显示肺炎支原体IgM阳性或IgM及IgG混合抗体浓度≥1：160，9例在入院1周后抗体浓度呈4倍升高从而诊断MPP，对所有儿童肺炎患儿检测血清蛋白指纹图谱，并进行分析，发现有差异的蛋白峰共有33个，通过人工智能神经网络软件自主挑选出6个蛋白峰，M/Z为4 094.91、4 650.51的2个蛋白峰在支原体肺炎中高表达，M/Z为5 825.38、6 031.77、7 862.79、10 122.04的4个蛋白峰在支原体肺炎组中低表达。用这6个蛋白峰建立的诊断模型MPP诊断的敏感性95.00%，特异性为88.57%，阳性率为92.00%，ROC曲线下面积为0.975，且蛋白指纹图谱检测可在1 h内完成。为MPP的早期诊断提供快速、灵敏度及特异性均高的诊断依据，同时为建立儿童MPP人群的蛋白质组学谱库提供重要资料。

该研究检测出有差异的蛋白峰共有33个，由于未设置健康儿童对照组，不能保证它们都是MPP与非MPP患者之间的差异蛋白，该研究进一步增加病例数，并设置健康儿童对照组，根据病原学进行分析，监测同一患者在不同时期蛋白指纹图谱的变化，将对蛋白指纹图谱技术在儿童MPP早期诊断的应用价值提供临床依据。

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（收稿日期：2017-02-10）