张旭，司浩浩，梁贝贝,段永红*，田晶*

(1.山西农业大学 农学院, 山西 太谷 030801; 2.吕梁学院 生命科学系， 山西 吕梁 033000)

产黄青霉菌发酵条件的优化及验证

张旭1，2，司浩浩1，梁贝贝2,段永红1*，田晶2*

(1.山西农业大学 农学院, 山西 太谷 030801; 2.吕梁学院 生命科学系， 山西 吕梁 033000)

[目的]产黄青霉菌是一种重要的真菌，广泛用于农业、环境、医疗等方面，其生长和产孢量受发酵条件的影响。为筛选产黄青霉菌最优发酵条件。[方法]本文选取不同的培养基、温度、pH、光周期、紫外线等条件，通过测量菌落的生长速率和产孢量，筛选出产黄青霉菌最优的发酵条件。[结果]SDAY培养基是最适培养基，在温度为25 ℃、pH为7、光周期为24 L、紫外线不照射时最适合产黄青霉菌生长，并验证最优发酵条件。[结论]本研究可为产黄青霉菌的大量生产提供理论依据，为该菌的进一步开发与利用奠定了研究基础。

产黄青霉菌； 菌落生长； 产孢量； 培养基

产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)隶属于青霉属的丝状真菌，是一种在自然界中普遍存在的霉菌[1～3]。产黄青霉菌具有大量生产青霉素的能力，现已成为生产青霉素的重要工业菌种[4]。青霉素是一种效果显著、毒害性小的抗生素，主要用于细菌导致的各种感染，可以杀灭细菌，临床应用十分广泛[1]。明确产黄青霉的最适发酵条件，可为其生产大量青霉素提供基础理论条件。

近年来，人们对青霉素的需求大大提高，许多学者利用紫外线诱变、高能电子诱变技术等方法来提高产黄青霉菌生产青霉素的能力[5]。基因工程的兴起，为产黄青霉菌的研究提供了新技术、新方法[3]。随着时代的进步，人们对基因工程有了进一步的了解，有研究表明将产黄青霉作为受体菌，通过选择某种特定的标记基因来建立表达系统，可以获得高效表达血红蛋白基因的菌种，在一定的发酵条件下可以促进青霉素的合成[6]。还可以利用RAPD技术，通过分析产青霉素菌株基因组的多态性寻找高产菌株，这种技术为高效生产青霉素提供了强有力的技术支持[7]。产黄青霉菌菌株的获得为青霉素的高产提供了前期保障，研究并明确产黄青霉菌菌株的生长及产孢的环境因子就显得尤为重要。目前，已有一些真菌的培养条件被优化，诸如环链拟青霉[8]、玫烟色拟青霉[9]、淡紫拟青霉[10]以及粉拟青霉[11]等。根据产黄青霉菌的生理代谢特性，已对其培养基成分进行了优化[12]。但尚未见产黄青霉菌菌株环境因子培养优化的报道。也尚未建立起适于该菌的培养体系。

本文以产黄青霉菌为研究对象，以菌落生长速率和产孢量为指标，分析产黄青霉菌在不同的培养基、温度、pH、光周期、紫外线的照射条件下的生长情况差异，筛选出最适合产黄青霉菌生长的发酵条件。为产黄青霉菌的大量生产提供理论依据，为该菌进一步开发与利用奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

先将保藏于冰箱中的产黄青霉菌进行活化，当菌丝生长达到培养皿2/3时，方可使用[13]。

1.2 接种与培养

1.2.1 无菌水的配制

将100 mL的蒸馏水进行灭菌20 min后方可使用。

1.2.2 孢子悬浮液的配制

取菌丝生长达到培养皿2/3的PDA培养基，加入5 mL的无菌水，用药匙将表面的菌丝刮下。将该混合体倒入无菌的锥形瓶内，反复几次。用玻璃棒搅拌均匀后，用纱布进行过滤，过滤掉残渣后得到的滤液为产黄青霉菌的孢子悬浮液。

1.2.3 接种

在超净工作台内，用镊子夹取直径为6 mm的滤纸片蘸取配置好的产黄青霉菌孢子悬浮液，将浸湿的滤纸片放置在培养基的平板中心。将每种培养基接种5个培养皿。培养时要将培养基放置在温度设定为25 ℃的培养箱倒置培养。

1.3 培养条件的设置

1.3.1 常见培养基的配方

将产黄青霉菌接种于表1中常见的6种培养基中。然后进行培养，每个进行3次重复。

1.3.2 温度

按照1.2所述方法进行接种，设置5个温度梯度：15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃。将培养基分别放置在上述温度的培养箱中培养，每个进行3次重复。

1.3.3 pH

按照1.2所述方法进行接种，设置5个pH梯度：5、6、7、8、9，每隔4 h用NaOH和HCl调节PDA培养基的pH[14]。然后进行培养，每个进行3次重复。

1.3.4 光周期

按照1.2所述方法进行接种，控制光周期分别为24L、16L/8D、12L/12D、8L/16D、24D 的条件下进行培养，每个进行3次重复。

1.3.5 紫外线

按照1.2所述方法进行接种，设置五个紫外线时间照射梯度：1 min、2 min、3 min、4 min、5 min，并以不照射的平板做为对照。然后进行培养，每个进行3次重复。

表1 常见的固体培养基配方

Table 1 Common solid culture medium formula

培养基Medium培养基成分MediumcomponentsPDA土豆200g；葡萄糖20g；琼脂17g；蒸馏水1LPSA土豆200g；蔗 糖20g；琼脂17g；蒸馏水1LSDA蛋白胨10g；葡萄糖40g；琼脂15g；蒸馏水1LSDAY蛋白胨10g；葡萄糖40g；琼脂15g；酵母粉2g；蒸馏水1LSMAY蛋白胨10g；麦芽糖40g；琼脂15g；酵母粉2g；蒸馏水1LCzapekNaNO32g；K2HPO41g；KCI05g；MgSO405g；FeSO4001g；蔗糖30g；琼脂17g；蒸馏水1L

1.4 生物学指标测定

1.4.1 菌落生长速率计算

接种后，从第2 d起每一天的同一时间进行菌落直径的测量，总测5次。测量直径时，以6 mm的滤纸片的中心为原点画十字，沿着直线分别测量两个垂直方向的直径，取其平均值。计算产黄青霉菌在不同培养基中的生长速率，同时观察产黄青霉菌菌落和菌丝的形态特征，并在无菌箱拍照记录[15]。

1.4.2 产孢量测定

当测量完菌落直径后，用打孔器在培养基中长势均匀的菌落上取5个菌饼。用夹子夹取5个菌饼放置在100 mL锥形瓶内，添加5 mL无菌水，搅拌均匀后过滤得到孢子悬浮液。用血球计数板对产孢量进行计数并记录[16]。

1.5 数据处理

试验数据的处理通过SPSS 13.0数据处理系统对其进行统计分析，计算均值和标准误差，分析均值差异显著性[17]。菌落生长的线性回归方程和相关系数用Excel软件计算。

2 结果与分析

2.1 最佳培养基的确定

根据表2中菌落直径以及产孢量的数据得出：在6种常见培养基上，产黄青霉菌的菌落直径(P=0.002)和产孢量(P<0.001)不同，有一定的差异性。在SDAY培养基上产黄青霉菌的菌落直径最大，为8.38 cm，并且生长速率最快，为1.648 cm · d-1，产黄青霉菌的产孢量为6.0×106孢子· mL-1，是其中最大。终上所述，最适合产黄青霉菌生长的培养基是SDAY培养基。

表2 不同培养基上产黄青霉菌的菌落直径和产孢量

注：经Duncan多重比较，表中同列相同的小写字母代表在0.05水平差异不显著。表3～表6同。

Note：Means in the same column followed by same letters are not significantly difference.P>0.05. The same with Table 3 to Table 6.

2.2 最佳温度条件的确定

从表3中可以看出产黄青霉菌在15～30 ℃都可以生长，但是菌落的直径(P=0.001)及产孢量(P=0.014)在不同的温度下培养有一定的差异。15～25 ℃内，伴随温度升高，菌落直径增大，生长速率加快，产孢量增大。在25 ℃时，菌落直径达到7.80 cm，为其中最大的，生长速率达到2.63 cm·d-1，为其中最快的，同时产孢量达到最大为2.6×106孢子·mL-1。25～35 ℃内，当温度上升，菌落的直径越小，生长速率越慢，产孢量逐渐减少。所以，温度在25 ℃时最适合产黄青霉菌生长。

表3 不同温度下产黄青霉菌的菌落直径和产孢量

2.3 最佳pH条件的确定

从表4的数据可知：产黄青霉菌在pH为5～9的范围内都可以生长，但是在不同的pH条件下，菌落的直径(P=0.004)有一定的差异，产孢量(P=0.104)差异不显著。pH在5～7时，酸性越弱，菌落直径越大，生长速率越大，产孢量也越大。在pH=7时，其直径达到最大为8.80 cm，生长速率最快为2.10 cm·d-1。在中性环境pH为7时，产孢量达到峰值为2.5×106孢子·mL-1。pH在7～9范围内，碱性越强，菌落直径越小，生长速率越慢，产孢量也在逐渐减少。所以，最适合产黄青霉菌生长的pH是7。

表4 不同pH下产黄青霉菌的菌落直径和产孢量

2.4 最佳光照条件的确定

从表5可以看出产黄青霉菌在不同的光周期培养的条件下，菌落的直径(P=0.003)及产孢量(P=0.003)有一定的差异。在光照时间为24L～12L/12D时，随着光照时间的减少，菌落的直径逐渐增大，生长速率逐渐变快。在12L/12D条件下，菌落直径达到最大为7.95 cm，生长速率最快为1.90 cm·d-1。光照周期为12L/12D～24D，随着光照时间的减少，菌落直径逐渐减小，生长速率逐渐变慢。光周期为24L～24D时，产孢量随之减少。在光照时间为24L时，产孢量达到最多为2.5×106孢子·mL-1。当光照时间为24 L时，最适合产黄青霉菌生长。

表5 不同光周期下产黄青霉菌的菌落的直径和产孢量

2.5 最佳紫外线照射时间的确定

从表6可以看出产黄青霉菌在不同时间紫外线照射下，菌落的直径(P<0.01)及产孢量(P<0.001)有一定的差异。随着紫外线照射时间的增加，菌落的直径逐渐减小，生长速率逐渐变慢，紫外线不照射时直径最大为7.80 cm，生长速率达到最大为2.18 cm·d-1。紫外线不照射时，产孢量最多为3.0×106孢子·mL-1。所以，当紫外线不照射时，产黄青霉菌生长最佳。

3 最佳反应条件的验证

通过对产黄青霉菌在不同的培养基、温度、pH、光周期、紫外线的照射条件下的生长情况进行研究观察，筛选出的适合产黄青霉菌生长的最佳发酵条件是在温度为25 ℃，初始pH为7的SDAY培养基中培养，光周期为24 L，不经紫外线的照射处理。我们对该最佳发酵条件做了验证，产黄青霉菌的生长情况如图1所示。可以看出：产黄青霉菌的长势比较好，菌落呈圆形，菌丝稠密，质地呈绒状。说明在该环境条件和营养条件下，比较适合培养产黄青霉菌。

表6 不同紫外线照射时间下产黄青霉菌的菌落直径和产孢量

图1 产黄青霉菌在SDAY培养基上的生长情况Fig.1 Growth of Penicillium chrysogenum in SDAY medium

4 结论与讨论

4 .1 产黄青霉菌最适培养基的确定

通过研究产黄青霉菌在六种常见培养基上菌落生长速率和产孢量，发现在SDAY培养基上的产黄青霉菌长势较好，其菌落生长速率和产孢量均优于其他培养基。可见，SDAY培养基为最适培养基。产黄青霉菌在6种固体培养基上都可以生长，说明该菌对营养的要求不高，在不同的碳源、氮源中都可以生长。

4 .2 环境条件对产黄青霉菌的影响

产黄青霉菌在不同的温度、pH、光周期、紫外线照射下均可以生长，表明该菌的生长对环境条件的要求不高。但是环境条件的差异与菌落的生长和产孢量有很大的关系。

温度是影响产黄青霉菌生长速度和产孢量的一个重要条件。温度过低时，产黄青霉菌不能正常生长。低温会影响原生质膜的状态，导致营养物质不能正常地进行运输。当温度升高时，细胞内的酶的活性增加，代谢速率也随之加快，生长速率加快。当温度过高时，会导致菌体内的蛋白质变性、DNA和RNA的结构发生变化。在温度为25℃，产黄青霉菌菌落的生长速度和产孢量最大。这一结果与玫烟色拟青霉最适液体培养条件的研究结果一致[10]。

pH也会影响产黄青霉菌的生长，酸性过强或碱性过强会使菌体表面蛋白质变性或水解。在酸性、碱性、中性环境中，产黄青霉菌均可以生长，但是在中性环境中，产黄青霉菌的生长速度最快，产孢量最多。王曦茁等[11]研究也表明培养基初始pH为6～7，更适合菌落的生长和产孢，这与本试验研究结果相同。

在不同的光周期下，产黄青霉菌的生长和产孢量有一定的差异。在光照时间为24 L时，最适合产黄青霉菌生长。这一研究表明：光照可以影响菌落的产孢和生长。吴丹丹等[18]也认为光照时间过长会加快培养基水分蒸发，不利于菌落的生长。该结果与朱新燕等[9]对环链拟青霉的研究结果一致，但张仙红等[10]的结果表明光照对菌落产孢和生长皆具有促进作用，研究结果的差异可能与菌种的差异相关。菌种的培养条件作为一个综合反应体系，受多个因素的影响和控制。

此外，产黄青霉菌的生长速率和产孢量也和紫外线照射的时间有关。随着紫外线照射时间的延长，产黄青霉菌的生长速度和产孢量逐渐降低，紫外线可以使蛋白质变性，破坏DNA和RNA的结构。在紫外线不照射条件下，产黄青霉菌的直径和产孢量最大。

综上所述，产黄青霉菌的最适发酵条件是温度为25 ℃，初始pH为7的SDAY培养基中培养，光周期为24 L，不经紫外线的照射处理。

[1]王成,张军剪,尹贵超.产黄青霉菌高能电子诱变选育[J].煤炭与化工, 2014, 37(2):68-69,73.

[2]陈聪,严慧,沈保华,等.青霉素类抗生素分析研究进展及其应用[J].中国司法鉴定,2010(6):36-40.

[3]李树强.产黄青霉遗传育种研究[D].石家庄：河北科技大学,2015.

[4]王顺,王培红,张楠,等.青霉素生产菌—产黄青霉的蛋白质组学研究进展[J]. 生物医学工程学杂志,2015,32(6):1354-1358.

[5]刘晓红.青霉素高产菌株HTS平台的建立[D].石家庄：河北科技大学,2010:3.

[6]朱彦民,刘晓均,孙妍红,等.产黄青霉菌中细菌血红蛋白的基因表达及工程菌的应用研究[J]. 高等学校化学学报,2004,25(5):858-861.

[7]刘静,戴梦,章丽,等.工业用产黄青霉菌基因组的RAPD多态性研究[J]. 河北师范大学学报(自然科学版), 2013, 37(6):622-625.

[8]朱新燕,李增智,樊美珍,等. 3株环链拟青霉固体培养条件的研究[J]. 安徽农业大学学报,2008,35(1):38-41.

[9]张仙红,张奂,张未仲. 玫烟色拟青霉最适液体培养条件的研究[J]. 微生物学杂志,2006,26(6):15-18.

[10]王曦茁,刘春秀,汪来发,等.淡紫拟青霉液体发酵条件的优化[J]. 四川农业大学学报,2012,30(4):410-414.

[11]杨斌,柳成益,姚金鹏,等.碳源、氮源及无机盐对粉拟青霉生长的影响[J]. 西南林学院学报,2005,25(1):9-12.

[12]周亮. 产黄青霉基因工程菌的生理代谢特性研究[D].上海:华东理工大学, 2013.

[13]谢春芹,韩荣梅,冯大俊,等.杏鲍菇母种最适固化培养基的筛选[J].江苏农业科学,2011,39(5):342-344.

[14]彭新安,丁奕,张丹,等.环境因子对一种病原真菌感染微藻细胞能力的影响[J].植物科学学报, 2016, 34(5):798 -806.

[15]刘智会,邓小芳,许晓明.玉簪白绢病菌最适培养基的筛选[J].中国林副特产, 2016(2):42-43,48.

[16]时玉华.关于血球计数板使用的教学探讨[J].中学教学参考,2011(32):123-124.

[17]田晶,梁丽,孟豪,等. 玫烟色棒束孢IF-1106菌株培养条件研究[J].山西农业大学学报(自然科学版),2014, 34(2):124-128.

[18]吴丹丹,黄少华,章玉苹,等.玫烟色拟青霉固体培养基筛选及培养条件研究[J].广东农业科学,2015(15):43-47.

(编辑：张贵森)

Optimization and verification of Penicillium chrysogenum fermentation conditions

Zhang Xu1，2, Si Haohao1, Liang Beibei2, Duan Yonghong1*, Tian Jing2*

(1.CollegeofAgriculture，ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.DepartmentofLifeScience,Lvlianglhiersity,Lvliang033000,China)

[Objective]Penicillium chrysogenum is an important fungi, widely used in agriculture, environment, health care, etc, The fermentation conditions exert a great influence on its growth and sporulation.[Methods]The mycelial diameter and sporulation were detected under different culture medium, temperature, pH, light cycle, ultraviolet conditions, then the optimal fermentation conditions of Penicillium chrysogenum was established.[Results]The result showed that the best suitable condition for the growth of P. chrysogenum were SDAY medium, at 25 ℃, pH 7, light period was 24 L, no ultraviolet irradiation.[Conclusion]This study provided a theoretical basis for a large number of production of Penicillium chrysogenum, and laid a foundation for the further development and utilization.

Penicillium chrysogenum， Mycelial growth， Culture medium， Sporulation

2017-01-02

2017-02-06

张旭(1994-)，女(汉)，山西长治人，硕士研究生，研究方向：作物育种学

*通信作者：段永红，副教授，研士生导师，Tel:15935101046;E-mail:duanyonghongok@163.com；田晶，讲师，Tel:13835898296;E-mail:396462640@qq.com

高梁遗传与种质创新山西省重点实验室开放课题(2015k-03);山西省科技攻关项目(20140311003-4)；山西省财政支农项目(2015TGSF-10)；国家公益性行业(农业)科研专项(201503121-07)

Q93-335

A

1671-8151(2017)06-0413-06