胡加谊，罗志文，何 凡，李向宏，胡福初，范鸿雁，刘志昕，张治礼

(1.海南省农业科学院 热带果树研究所，农业部海口热带果树科学观测实验站，海南省热带果树生物学重点实验室，海南 海口 571100；2.黄埔出入境检验检疫局，广东 广州 510730；3.中国热带农业科学院 热带生物技术研究所，海南 海口 571101)

同步检测PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的三重RT-qPCR方法的初步建立

胡加谊1，2，罗志文1，何 凡1，李向宏1，胡福初1，范鸿雁1，刘志昕3，张治礼1

(1.海南省农业科学院 热带果树研究所，农业部海口热带果树科学观测实验站，海南省热带果树生物学重点实验室，海南 海口 571100；2.黄埔出入境检验检疫局，广东 广州 510730；3.中国热带农业科学院 热带生物技术研究所，海南 海口 571101)

目前我国菠萝产区已相继报道3种菠萝凋萎相关病毒(PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3)。通过建立这3种菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)同步定量检测方法，为菠萝凋萎病毒的定性定量研究提供技术手段。根据这3种菠萝凋萎相关病毒的外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物和TaqMan水解探针，在优化PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR反应体系后，以PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3CP基因目的片段的重组质粒为标准品绘制标准曲线，初步建立了PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR检测方法。其中PMWaV-1标准曲线为y=-3.283logx+39.02，其扩增效率达101.7%，线性相关系数R2=0.999；PMWaV-2标准曲线为y=-3.393logx+37.53，其扩增效率为97.1%，线性相关系数R2=0.998；PMWaV-3标准曲线为y=-3.171 logx+38.48，其扩增效率为106.7%，线性相关系数R2=0.996；这表明3种菠萝凋萎相关病毒质粒标准品在同一反应体系中可稳定扩增，且线性关系表现良好，可用于后续试验。灵敏度试验数据表明，该方法对PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的最低检测线分别为99，98，868拷贝；……