朱成科，刘桂嘉，张争世，蒲德成，朱 龙，周朝伟，雷 骆，郑宗林



岩原鲤致病性维氏气单胞菌的分离与鉴定

朱成科1，刘桂嘉1，张争世1，蒲德成2，朱 龙1，周朝伟1，雷 骆1，郑宗林1

目的 2016年6月从重庆永川某养殖场濒临死亡的岩原鲤内脏分离到一株维氏气单胞菌，分析其生物学特征，为预防和治疗该病提供理论依据和参考。方法 从患病鱼体获得一株致病菌YY01，经形态学观察、生理生化特性测定、16S rRNA和gyrB基因序列分析其分类地位；通过人工感染试验和毒力基因检测确定其致病性，并同时开展药物敏感试验筛选其敏感药物。结果 病原菌16S rRNA与gyrB序列构建的进化树显示该菌与维氏气单胞菌同聚为一支，相似性在99%以上；结合其形态学特征和生理生化特性，确认为维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)。人工感染试验结果显示菌株YY01对岩原鲤的半致死量为5.06×104CFU/g。通过病原菌毒力基因检测发现，能从菌株YY01基因组中扩增到气溶素(Aer)、溶血素(Hly)、外膜蛋白(OmpA)和黏附素(Aha)4种毒力基因。药敏试验表明菌株YY01对多粘霉素B、阿米卡星、先锋霉素V等22种药物敏感；对青霉素、羧苄西林等11种药物耐药。结论 所检出的维氏气单胞菌为岩原鲤的致病菌，该菌对岩原鲤有较强的致病性。

维氏气单胞菌；岩原鲤；致病性；药敏试验

Supported by the Ecological Fishery Industry Technology System of Chongqing (Nos. 40800115 and 40800216) and the Youth Foundation of Southwest University Rongchang Campus (No. 20700913) Corresponding author: Zheng Zong-lin, Email: zhengzonglin@126.com

岩原鲤(Procyprisrabaudi)又名岩鲤、黑鲤鱼，隶属鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲤亚科(Cyprininae)，原鲤属(Procypris)，主要分布于我国长江中上游及其支流水域，属杂食性底层鱼类，其肉质细嫩，味道鲜美，少肌间刺，含肉率高，是上等的食用鱼类，市场前景广阔[1]。近年来，由于长江中上游水体污染和过度捕捞，加上三峡枢纽等水利设施的兴建，严重破坏了岩原鲤的栖息环境，其野生资源锐减，已被列为《中国濒危动物红皮书(鱼类)》中的易危物种[2]。随着重庆、四川、湖北、贵州等省市相继开展了岩原鲤的人工繁殖和养殖技术研究，极大地推动了岩原鲤养殖业的发展。近年来，随着养殖密度的加大，集约化程度的增高，岩原鲤养殖环境恶化，各种细菌性疾病、真菌性疾病和寄生虫病频发，严重困扰着岩原鲤养殖业的健康发展。其中，细菌性疾病对岩原鲤危害最为严重，目前报道的主要有嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、肠形点状气单胞菌(A.punctataf.intestinalis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)和柱状黄杆菌(Flavobacteriumcolumnare)等[3-4]。

2016年6月，在重庆永川某养殖场出现岩原鲤大批患病并出现死亡的现象，患病鱼主要临床症状为：体表充血，肛门红肿、外突，鳍条基部充血发红，腹部肿胀，腹腔中大量红色腹水，内脏点状出血，肠道充血等症状。本实验室研究人员从自然发病鱼体内脏实质器官进行了病原菌分离，并通过病原菌形态学观察、生理生化测定和分子生物学特性进行鉴定确定，该菌为维氏气单胞菌(A.veronii)，同时进行了病原菌药物敏感性及毒力基因的检测，以期为该病的致病机制和有效病害防控研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 病鱼采自重庆市永川区某养殖场，体质量为150-250 g，具有典型的临床症状。健康岩原鲤购自重庆市万州区水产研究所，体长为15.3±1.5 cm，体质量为53.6±4.2 g，暂养于90×50×60 cm的水族缸中，试验用水为充分曝气的自来水，水温(26.5±1.0)℃，pH 7.0-7.5，观察7 d确认健康无异常后进行人工感染试验。

1.2 主要试剂和仪器 普通营养琼脂培养基(Oxoid公司)，细菌DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，PCR反应体系(Takara公司)，pMD-19T(Takara公司)，API 20E试剂盒(Biomerieux公司)，药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)；恒温摇床(江苏省金坛市盛威实验仪器厂)，生化培养箱(宁波新芝生物科技股份有限公司)，核酸蛋白测量仪(德国eppendef公司)，PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)，DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)等。

1.3 病原菌的分离与培养 选取患病症状典型的濒临死亡岩原鲤，在无菌操作台中，用70%酒精棉球擦拭鱼体，用接种环取其肝、脾、肾和腹水分别于普通营养琼脂平板上进行划线，在28 ℃生化培养箱中培养24 h，观察细菌菌落生长状况，然后挑取形态一致的单个优势菌落在营养琼脂培养基平板中，再次纯化培养24 h，将纯化后的分离菌株用营养琼脂斜面培养基4 ℃保存备用。

1.4 病原菌的形态观察 将纯化的菌株接种于营养琼脂培养基28 ℃培养24 h，观察菌落形态特征。挑选单菌落经革兰氏染液染色后，在显微镜下观察细菌形态。

1.5 人工感染试验 将分离菌株涂布接种于营养琼脂培养基上，28 ℃恒温培养箱中培养8 h，用0.65%无菌生理盐水洗脱，参照麦氏比浊法调整菌液浓度，稀释成1.0×108CFU/mL、1.0×107CFU/mL、1.0×106CFU/mL、1.0×105CFU/mL的菌悬浊液。采用胸鳍注射法，每尾鱼分别注射各浓度菌液0.2 mL，15尾/组。空白对照组注射等量0.65%无菌生理盐水。接种后观察鱼的发病和死亡情况，对上述感染死亡的鱼进行致病菌分离鉴定和感染试验。

1.6 病原菌生理生化特征鉴定 参照ATB系统细菌自动鉴定仪(法国Bio-merieux公司)API 20E试剂盒使用说明进行细菌鉴定，鉴定结果参照参考《伯杰氏细菌鉴定手册》[5]和《常见细菌系统鉴定手册》[6]的标准判断细菌的种类。

1.7 16S rRNA和gyrB序列的扩增和测定

1.7.1 菌株DNA提取：无菌条件下，在5.0 mL的EP管中加入1.0 mL普通肉汤液体培养基，将单个活化的菌群接种在其中。于恒温振荡器中28 ℃，120 r/min培养6 h后，4 000 r/min离心1 min，弃上清液。参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取制备DNA。

1.7.2 16S rRNA和gyrBPCR扩增：采用一对16S rRNA基因PCR扩增的通用引物F-D1/R-D1。上游引物为F-D1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物为R-D1：5′-AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3′[7]。采用一对gyrB基因PCR扩增的通用引物3F/14R。上游引物为3F：5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′；下游引物为14R：5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′[8]。PCR用25 μL反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mM MgCl21.5 μL，10 mM dNTP 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，rTaq酶(5 U/μL)0.25 μL，ddH2O 补足余下体积。基因扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共31个循环；最后，72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。用TaKaRa公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物回收纯化，pMD-19T载体连接，转化进DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆送上海英骏生物技术测序公司测序。

1.7.3 序列分析与系统发育树的构建：将菌株的16S rRNA和gyrB基因序列在GenBank数据库中的Blast进行相似性比较。采用MEGA 4.0软件构建系统发育树，通过自举分析(bootstrap)进行置信度检测，自举数集1000次。

1.8 病原菌毒力基因的检测 以分离菌株的DNA为模板，对气溶素基因(Aer)[9]、溶血素基因(Hly)[10]、外膜蛋白基因(OmpA)[11]和黏附素基因(Aha)[11]进行PCR扩增。引物序列、退火温度和片段大小见表1。在用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小，TaKaRa琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物回收纯化，克隆并测序。

表1 相关毒力基因的引物序列
Tab.1 Sequence of oligonucleotide primers used in the study

毒力基因Virulencegene引物序列Oligonucleotidesequence退火温度(℃)Annealingtemperature(℃)片段大小(bp)Productsize(bp)AerF:GAGCGAGAAGGTGACCACCAAGAAC56417R:TTCCAGTCCCACCACTTCACTTCACHlyF:ATTATCAAGCTTTTAAAACTGGCTC55432R:ATCAAGCTTTTAAAACTGGCTCTCGGCOmpAF:GCTATCCCGGCTCTGTTCGCATCT56903R:CAGCAGGGTTTCGTCAAGCAGGTCAhaF:GGCTATTGCTATCCCGGCTCTGTT58998R:CGGTCCACTCGTCGTCCATCTTG

1.9 药敏试验 药敏试验采用K-B法进行。将菌悬液制成1.0×108CFU/mL。用无菌棉签蘸取菌悬液均匀涂布在营养琼脂培养基上，贴上药敏纸片，置于28 ℃恒温培养24 h测定抑菌圈直径大小。参照说明书判断药物敏感性。

2 结 果

2.1 致病菌分离 从濒临死亡病鱼肝、脾、肾分离到一株优势病原菌，编号为YY01。菌株YY01在普通肉汤液体培养基中生长良好，培养液中浑浊均匀。在普通肉汤琼脂平板上28 ℃培养24 h，形成圆形、边缘整齐、隆起、光滑湿润、灰白色至淡黄色，直径在1.0-1.5 mm的菌落。经革兰氏染色镜检可见革兰阴性短杆菌，菌体大小为1.50×0.48 μm，两端钝圆或平直，多数单个排列。

2.2 人工感染试验 胸鳍基部注射菌株YY01后，攻毒后7 d各组岩原鲤死亡结果见表2。由表2可见，高浓度组(1.0×108CFU/mL)岩原鲤在2 d内全部死亡，死亡率高达100%；1.0×107CFU/mL组在攻毒后7天内累积死亡率为73.3%，对照组无鱼体死亡，表明分离菌株具有较强的致病性。人工感染死亡的岩原鲤出现下颌、鳍基出血，腹部膨大，肛门红肿，解剖后，腹部出现腹水，恶臭等症状，与自然发病岩原鲤症状和病变相似。并从人工感染濒临死亡的试验鱼肝、脾脏和腹水中分离到一株优势菌，该菌形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定结果与菌株YY01一致，表明YY01是该病的病原菌。通过人工感染试验结果，根据改良寇氏法[12]计算出菌株YY01的半致死浓度LD50为：5.06×104CFU/g。

表2 菌株YY01对健康岩原鲤人工感染试验结果
Tab.2 Results of artificial infection of YY01 inProcyprisrabaudi

注射浓度Concentration(CFU/mL)鱼数No.(n)感染7d内每d死亡尾数Deathno.ineachday1234567死亡总数No.ofdeath(n)死亡率Mortalityrate/%1.0×108151140000015100.01.0×1071525310001173.31.0×106150210100426.71.0×10515000100016.70.65%NaCl15000000000.0

2.3 生理生化鉴定结果 菌株YY01的VP试验、MR试验和七叶灵水解阳性；产生吲哚，不能产生H2S；赖氨酸脱羧酶、氧化酶阳性，精氨酸双水解酶阴性；能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖、麦芽糖和纤维二糖，不能利用阿拉伯糖、肌醇、卫矛醇、乳糖、棉籽糖、木糖、鼠李糖、水杨苷，其生理生化特性见表3。经ATB Expression生化自动鉴定仪(IS32 STREP)软件的分析结果，可初步鉴定分离菌株为维氏气单胞菌。

2.4 基因序列分析与系统发育树的构建 用细菌的16S rRNA和gyrB通用引物，经PCR扩增获得预期条带大小约为1 500 bp和1 200 bp(如图2)，与预期的结果相一致。对目的条带进行割胶回收、纯化、连接、转化、挑选阳性克隆测序，菌株YY01所获得的16S rRNA和gyrB序列片段大小分别为1 497 bp和1 084 bp。

菌株YY01 16S rRNA(登录号：KY624577)与GenBank上登录的维氏气单胞菌(登录号：AF099024和HQ407242)的相似性高达99.9%；菌株YY01gyrB基因(登录号：KY624576)与GenBank上登录的维氏气单胞菌(登录号：KR537458)的相似性高达100.0%。根据YY01菌株16S rRNA和gyrB基因序列与GenBank已登录的其它气单胞菌属序列，并以霍乱弧菌(V.cholerae)和副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)为外类群，运用MEGA4.0软件分别建立系统进化树，结果显示，YY01均与维氏气单胞菌聚为一支(支持率均为100%)，见图2、图3。

2.5 毒力基因的检测结果 根据维氏气单胞菌Aer、Hly、OmpA、Aha基因设计基因特性引物，进行特异性PCR扩增，分别获得大小约410 bp、430 bp、900 bp和1 000 bp的DNA片段(图4)，与预期结果相符。从而进一步说明引起岩原鲤患病的维氏气单胞菌菌株YY01含有AerA、Hly、OmpA、Aha基因，从分子水平上说明该菌株具有较强的致病性，与人工回归感染结果相一致。

表3 分离菌株YY01的生理生化特征
Tab.3 Biochemical and physiological characteristics of the isolated strain YY01

实验项目 Items结果Result实验项目 Items结果ResultD-葡萄糖(D-glucose)+卫矛醇(Galactitol)-D-甘露醇(D-mannitol)+乳糖(Lactose)-蔗糖(Sucrose)+棉籽糖(Raffinose)-阿拉伯糖(Arabinose)-木糖(Xylose)-肌醇(Inositol)-鼠李糖(Rhamnose)-赖氨酸脱羧酶(Lysdecarboxylase)+氧化酶(Oxidase)+精氨酸双水解酶(Argdihydrolase)-脲酶(Urease)-鸟氨酸脱羧酶(Orndecarboxylase)-硫化氢(H2S)-苯丙氨酸脱氨酶(Phedeaminase)-吲哚(Indol)+七叶灵水解(Esculinhydrolyse)+水杨苷(Salicin)-丙二酸盐(Malonate)-纤维二糖(Cellobiose)+麦芽糖(Maltose)+0%NaCl+VP(Voges-Proskauertest)+3%NaCl+MR(Methyl-Redtest)+6%NaCl-葡糖糖产气(D-glucoseproducinggas)+8%NaCl-枸椽酸盐(Citrate)-10%NaCl-

Notes: “+” indicates positive, “-” indicates negative.

M: DL2000 DNA maker; 1: gyrB; 2: 16S rRNA; 3: negative control图1 病原菌株YY01的gyrB和16S rRNA基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of gyrB and 16S rRNA gene in strain YY01

图2 菌株YY01 16S rRNA基因序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences.

图3 菌株YY01 gyrB基因序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on gyrB gene sequences

M: DL2000 DNA maker; 1：Aer；2：Hly；3：OmpA；4：Aha；5：negative control图4 菌株YY01的毒力基因片段电泳结果Fig.4 PCR amplification of four virulence genes of strain YY01

2.6 药敏试验 本试验检测了YY01对40种抗生素(包括大环内酯类、β-内酰胺类、四环素类、硝基呋喃类、磺胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、氯霉素类、林可霉素类和其它类抗生素)的药物敏感性，见表4。结果显示YY01对多粘霉素B、阿米卡星、先锋霉素V、呋喃妥因和呋喃唑酮等22种药物敏感；对链霉素、妥布霉素、庆大霉素、先锋霉素Ⅵ、利福平等8种药物中度敏感；对青霉素、羧苄西林等10种药物耐药。

3 讨 论

菌株YY01的形态学特性和生理生化的检测结果与维氏气单胞菌非常相似，且维氏气单胞菌区别气单胞菌属其它细菌的主要特征为赖氨酸脱羧酶阳性、精氨酸双水解酶阴性[13]。结合《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》[5-6]进行种类鉴定，初步确定该病原菌为维氏气单胞菌(A.veronii)。但菌株YY01苯丙氨酸脱氨酶、水杨苷和纤维二糖阴性与维氏气单胞菌模式菌株ATCC35624存在差异，其原因可能是同一种细菌在不同地域分离获得，存在个体差异引起[14]。为了进一步确定分离菌株的分类地位，本研究采取了细菌的16S rRNA和gyrB。16S rRNA基因进化速率缓慢，功能保守，被称为细菌“分子化石”，常用于细菌的分类鉴定[15]，但对同属亲缘关系较近的种间关系分辨率不够[16]。gyrB基因属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰和修复有关的蛋白编码基因，对细菌DNA的转录和复制很重要[17]。研究发现gyrB基因相对于16S rRNA具有较高的替换率，并且作为蛋白编码基因，特别适合亲缘关系较近的菌种区别和鉴定[8]。本研究分离到了菌株YY01gyrB基因与登录已知维氏气单胞菌相似性高达99.0%以上，而与气单胞菌属其它菌种相似性低于95.0%，结合生理生化鉴定结果，鉴定分离菌株为维氏气单胞菌(A.veronii)。因此，在病原菌的鉴定过程中，将细菌形态学和生理生化特性结合分子生物学鉴定相结合，鉴定结果更精确。

表4 菌株YY01的药敏试验结果
Tab.4 Sensitivity of strain YY01 to antibiotics

抗生素种类Classesofantibiotics药物名称Drugs纸片含量/μgDose:g/disc判断标准AssessmentcriteriaRIS抑菌圈直径/mmDiameterofinhibition/mm敏感性Sensitivity大环内酯类Macrolidesgroup红霉素Erythromycin15≤1314-22≥2313R交沙霉素Josamycine15≤1314-22≥2310R吉他霉素Kitasamycin15≤2122-30≥3112Rβ-内酰胺类β-lactamgroup头孢他啶Ceftazidime30≤1415-17≥1829S头孢哌酮Cefoperazone75≤1516-20≥2130S先锋霉素ⅣCephalosporinⅣ30≤1415-17≥1822S先锋霉素VCephalosporinV30≤1415-17≥1820S哌拉西林Piperacillin100≤1718-20≥2124S氨曲南Aztreonam30≤1516-21≥2233S头孢曲松Ceftriaxone30≤2525-26≥2737S先锋霉素ⅥCephalosporinⅥ30≤1415-17≥1817I青霉素Penicillin10≤1920-27≥280R羧苄西林Carbenicillin100≤1920-22≥230R氨苄西林Ampicillin10≤1314-16≥170R阿莫西林Amoxicillin10≤1819-25≥260R四环素类Tetracyclinesgroup四环素Tetracycline30≤1414-20≥2128S米诺环素Minocycline30≤1415-17≥1828S强力霉素Doxycycline30≤1415-18≥1928S硝基呋喃类Nitrofuransgroup呋喃唑酮Furazolidone300≤1415-16≥1722S呋喃妥因Nitrofurantoin300≤1415-16≥1721S磺胺类Sulfonamidesgroup复方新诺明Cotrimoxazole23.75≤2324-32≥3320R磺胺甲基异恶唑Benzenesul-fonamide250≤1415-23≥2416I氨基糖苷类Aminoglycosidesgroup阿米卡星Amikacin30≤1415-16≥1717S庆大霉素Gentamicin10≤1213-14≥1514I妥布霉素Tobramycin10≤1213-14≥1514I新霉素Neomycin30≤1213-16≥1716I卡那霉素Kanamycin30≤1314-17≥1817I链霉素Streptomycin10≤1112-14≥1512I喹诺酮类Quinolonesgroup环丙沙星Ciprofloxacin5≤1516-20≥2137S培氟沙星peflacin10≤2324-25≥2632S左氧氟沙星Levofloxacin5≤1314-16≥1733S吡哌酸Pipemidicacid30≤2122-28≥2930S氧氟沙星Ofloxacin5≤1213-15≥1634S诺氟沙星Norfloxacin10≤1213-16≥1735S氯霉素类Chloromycetinsgroup氯霉素Chloromycetin30≤1213-17≥1830S氟苯尼考Florfenicol30≤1213-17≥1829S林可霉素类Lincomycingroup林可霉素Lincolmensin2≤2324-30≥310R其它类抗生素Othersantibioticsgroup多粘霉素BPolymyxinB300≤89-11≥1212S利福平Rifampicin5≤1617-19≥2018I杆菌肽Bacitracin10≤89-12≥130R

S: Sensitive; I: Intermediate; R: Resistant.

维氏气单胞菌(A.veronii)亦被称为维罗纳气单胞菌，普遍存在于海水、淡水、污水和土壤中，是一种重要的人—畜—鱼共患致病菌[18]，在人免疫力低下时，维氏气单胞菌可引发腹泻、脑膜炎和败血症等病症[19-20]。李伟杰等[21]报道了该菌能引起狐狸(Vulpesvulpes)腹泻等疾病，严重的将致其死亡。维氏气单胞菌也是对水产动物造成危害较大的病原菌，潘晓艺等[22]报道了该菌能引起青虾(Macrobrachiumnipponense)掉肢、软壳、肝胰腺发黄和肌肉水肿等症状，导致大量死亡。房海等[23]从濒临死亡的中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)肝胰脏中分离到该菌，病蟹体腔内积水，鳃暗灰色，肝胰腺呈浅黄等症状。团头鲂(Megalobramaamblycephala)、框镜鲤(Cyprinuscarpio)、西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)、斑点叉尾鮰(Ictalunespunctatus)等养殖鱼类感染该菌后，主要表现溃疡、出血和腹水等症状[18, 24-26]。此外，国内还有该菌引起大鲵(Andriasdavidianus)[27]和中华鳖(Trionyxsinensis)[28]感染死亡的研究报道。

维氏气单胞菌致病机制较为复杂，目前研究表明该菌能产生黏附素、细胞毒素、肠毒素、气溶素和溶血素等毒力因子，这些毒力因子相互作用在水产动物感染过程中起着重要作用[29]。因此研究病原菌的毒力基因在探讨该菌致病机制尤为重要，据报道，Aer、Hly、OmpA、Aha为维氏气单胞菌重要毒力基因，其中，气溶素(Aer)可以使全身脏器广泛出血，并破坏宿主细胞膜，导致细胞死亡，产生气溶素是气单胞菌具有致病性的重要标志之一[9,18]；溶血素(Hly)是基因组DNA编码的毒力因子，形成共聚后插入细胞膜上，形成管道，导致溶血[10]；外膜蛋白(OmpA)在增强细菌粘附作用，维持外模结构、逃避宿主杀伤起到重要作用[30]；黏附素(Aha)能促进细菌粘附、侵袭以及对宿主防御机能的抵抗[31]。总之，这些毒力基因在病原菌粘附、侵袭、增殖、抵抗机体防御和释放毒素过程中有着重要作用，本研究从致病菌株YY01检测到上述4种毒力基因，表明菌株YY01为较强致病菌株，这与人工感染试验相佐证，且从分子生物学层面进一步确认分离到的病原菌为维氏气单胞菌(A.veronii)。

药敏试验表明菌株YY01对β-内酰胺类中的头孢他啶等7种抗生素、四环素等3种四环素类抗生素、呋喃唑酮等2种硝基呋喃类抗生素、对环丙沙星等6种喹诺酮类抗生素、对氯霉素等2种氯霉素类抗生素敏感；对红霉素等3种大环内酯类抗生素、β-内酰胺类中的青霉素等4抗生素、对庆大霉素等5种氨基糖苷类抗生素耐药，此结果为岩原鲤防治该病提供了科学依据。但药敏试验结果与从青虾(M.nipponense)[22]、框镜鲤(C.carpio)[24]、西伯利亚鲟(A.baerii)[25]和中华鳖(T.sinensis)[28]体内分离到的维氏气单胞菌药敏特性不尽相同，这可能是菌株不同来源、不同区域及抗生素药物使用史等原因有关。因此在该病实际防治过程中，应该参照分离菌株的药敏试验结果，同时结合国家允许的渔用药物准则(NY5071-2002，无公害食品、渔用药物使用准则[S])，选择最有效的药物开展治疗，谨防菌株抗药性的产生。

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Identification of a pathogenicAeromonasveroniiisolated from rock carp,Procyprisrabaudi

ZHU Cheng-ke1, LIU Gui-jia1, ZHANG Zheng-shi1, PU De-cheng2, ZHU Long1,ZHOU Chao-wei1, LEI Luo1, ZHENG Zong-lin1

(1.DepartmentofFisheriesinRongchangCampus,SouthwestUniversity,Chongqing402460,China;2.AgricultureCommitteeofWuxi,Chongqing405899,China)

In June 2016, a disease among the cultured rock carp (Procyprisrabaudi) in Yongchuan of Chongqing Municipality occurred. The aim of this study was to investigate biological characteristics and provide reference forAeromonasveroniiidentification diagnosis and treatment. Pathogenic bacteria strain YY01 from the dying fishes were examined and isolated. Strain YY01’s taxonomic status was identified by observing the morphology, studying the physiological and biochemical characters and sequencing the 16S rRNA and housekeeping genegyrB. Its pathogenicity was checked by artificial infection experiment and virulence genes. Furthermore, effective medicine was detected by drug sensitivity. The 16S rRNA andgyrBgene sequence of the strain YY01 was more than 99% homology with that ofAeromonasveronii, suggesting that the pathogen wasAeromonasveronii, which was also identified by the results of biochemical analysis. The LD50of strain YY01 to rcok carp was 5.06×104CFU/g. Four virulence genes were detected from YY01, including aerolysin (aer), hemolysin (Hly), Outer Membrane Protein Gene A (OmpA) and adhesion (Aha) genes. Antibiotic sensitivity assays showed that among 40 antibiotics tested, 22 were sensitive and 11 were resistant. In conclusion, the strain YY01 is identified asAeromonasveroniiand it is proved to have strong pathogenicity.

Aeromonasveronii;Procyprisrabaudi; pathogenity; antibiotic susceptibility test

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.011

郑宗林，Email: zhengzonglin@126.com

1.西南大学荣昌校区水产系，重庆402460； 2.巫溪县农业委员会，重庆405899

R378

A

1002-2694(2017)06-0527-09

2017-02-27 编辑：李友松

重庆市生态渔业技术体系建设专项资金(No.40800115，40800216)和西南大学荣昌校区青年基金(No.20700913)联合资助