陈柯斐,王鸿飞,王春幸,熊 茜,宋佳敏,程佑声,许 凤

(宁波大学食品科学与工程系,浙江宁波 315211)



蓝莓皮渣花色苷抑菌活性及抑制癌细胞增殖作用研究

陈柯斐,王鸿飞*,王春幸,熊 茜,宋佳敏,程佑声,许 凤

(宁波大学食品科学与工程系,浙江宁波 315211)

以乙醇为溶剂从蓝莓果皮中提取得到蓝莓皮渣花色苷,采用高效液相色谱分析蓝莓皮渣花色苷组分,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌三种细菌为代表,用牛津杯法考察其抑菌效果,初步确定蓝莓皮渣花色苷的抑菌谱,采用两倍稀释法确定其最低抑菌浓度。采用MTT法检测不同质量浓度花色苷抗结肠癌、胃癌、肝癌细胞增殖活性。蓝莓皮渣花色苷对三种细菌都有抑制作用,其MIC分别为0.63、0.63、1.25 mg/mL。蓝莓皮渣花色苷对三种癌细胞都具有一定的抑制率,其抑制结肠癌、胃癌、肝癌的IC50分别为7.54、13.34、21.05 μg/mL。蓝莓皮渣花色苷甘具有一定的抑制细菌和癌细胞增殖的效果,对于开发研制新型抗癌药物具有重要的理论和实际意义。

蓝莓皮渣,花色苷,肿瘤,抑菌活性

蓝莓(Blueberry)属于杜鹃花科(Ericaceae),越橘属(Vacciniumspp.),又名越橘,为多年生落叶或常绿灌木[1]。蓝莓富含多种营养成分,有“浆果之王”的美誉。除了含常规的有机酸、糖以外,还富含多种维生素、超氧化物歧化酶(SOD)、不饱和脂肪酸、矿物质等成分,以及花色苷等特殊成分,其中果皮中含有大量的生物活性成分,尤其是花色苷的含量特别高[2]。研究表明,花色苷是一种由花青素和糖以糖苷键结合成的水溶性生物活性物质,属于黄酮类化合物,具有较多的生理活性功能,包括抗氧化及消除自由基、降低血清及肝脏中的脂肪含量、促进视红素再合成、提高免疫力、增强心脏功能、延缓衰老、抗炎症及抗肿瘤等多种生理活性功能[3-5]。癌症是世界上死亡率极高的疾病,但许多研究都表明日常食用的蔬菜和水果中富含的花色苷类化合物可以起到预防癌症和抑制肿瘤细胞增殖的功效[6]。近年来,植物活性成分的抑菌作用受到广大学者的广泛重视并取得较大进展,如黄酮、花青素等酚类物质的杀菌作用被发现。花色苷作为黄酮类化合物,已报道证实具有抑菌作用[7]。目前对蓝莓资源的研究主要集中在鲜果的贮藏保鲜及果汁、饮料的加工,对加工剩余的蓝莓皮渣的综合利用研究较少。

本研究采用溶剂浸提法提取蓝莓皮渣中的花色苷,采用高效液相色谱分析蓝莓皮渣花色苷组分,选用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌三种细菌为代表,采用牛津杯法考察其抑菌效果,初步确定蓝莓皮渣花色苷的抑菌谱,采用两倍稀释法确定其最低抑菌浓度,用MTT法检测不同质量浓度花色苷抗结肠癌、胃癌、肺癌和肝癌细胞增殖活性,以进一步揭示蓝莓皮渣花色苷的抗肿瘤作用机理。实验为进一步研究蓝莓皮渣花色苷的生理活性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓皮渣 浙江聚仙庄饮品有限公司;甲醇(色谱纯) 国药集团化学试剂有限公司;二甲基亚砜(DMSO) sigma公司;RPMI Medium 1640 Invitrogen corporation;甲基噻唑基四唑(MTT) sigma公司;小牛血清 杭州四季清公司;胰蛋白酶 酶活力大于3800 u/mg;营养琼脂培养基 杭州微生物试剂有限公司;乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、无水乙醇 均为分析纯；细胞株 人体肝癌细胞株HepG-2、结肠癌细胞株HT-29、胃癌BGC-823 武汉博士德生物工程有限公司；金黄色葡萄球菌(Staphylococusaureus,ATCC29213)、大肠杆菌(Escherichiacoli,ATCC10798)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis,ACCC11025) 中国普通微生物菌种保藏中心。

H2050R台式高速冷冻离心机 湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司;Zorbax SB C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美国Agilent公司;KHB ST-360型自动多功能酶标仪 上海科华实验系统有限公司;BB15型二氧化碳培养箱 美国Thermo;CKX41型倒置显微镜 日本OLYMPUS;SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;DNP-9162型电热恒温培养箱 宁波江南仪器厂;LDZX-40BⅠ型立式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;SHZ-82型气浴恒温振荡器 金坛市科析仪器有限公司;SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;牛津杯(外径8 mm,内径6 mm)、培养皿等。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓皮渣花色苷提取工艺流程 蓝莓皮渣解冻后于40 ℃干燥6 h,粉碎过筛(60目),准确称取5 g粉末,用60 %酸性乙醇提取花色苷,提取温度为40 ℃,提取时间1.5 h,5000 r/min离心10 min后抽滤,收集滤液,40 ℃减压浓缩得到粗提液,得到蓝莓皮渣花色苷提取液[8-9],测定花色苷含量为16.324 mg·g-1。

1.2.2 液相色谱分离鉴定 取2 mL花色苷提取液吸附在C18吸附树脂小柱上,洗去柱子上吸附的糖、蛋白等物质,纯化后得到花色苷溶液以备液相色谱测定。液相色谱条件:色谱柱:Agilent Zorbax SB C18柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm),柱温30 ℃,进样体积20 μL;流动相:A相为0.2%(V/V)乙腈溶液,B相为甲酸溶液;梯度:0～5 min,10% A;5～20 min,10%～30% A;25～30 min,10% A;流速1 mL/min;DAD扫描波长范围225～600 nm,检测波长535 nm,对分离的花色苷色谱峰进行紫外-可见光谱分析[10-11]。

含量(mg·g-1)=样品峰面积×标准品浓度(mg·g-1)×样品体积(μL)/(标准品峰面积×取样量(μL))

式(1)

1.2.3 蓝莓皮渣花色苷抑菌活性研究

1.2.3.1 供试菌株的活化 在超净工作台中,将供试菌株接入相应的试管斜面培养基上,置于37 ℃培养箱内培养18～24 h,培养完之后将培养基置于0～4 ℃冷藏备用。用接种环从斜面培养基上挑去一环置于10 mL灭菌培养基中,于37 ℃摇床中培养24 h后,菌悬液浓度约为106～107CFU/mL[12]。

1.2.3.2 蓝莓皮渣花色苷抑菌活性的测定 吸取1 mL菌悬液于灭菌的培养皿中,将冷却至40～50 ℃的固体培养基倒入平皿中,轻轻摇匀静置冷却。将牛津杯轻轻放置于平板上,每皿设置样品组,对照(相应溶剂、无菌水),每组设3个平行。然后在37 ℃暗处培养24 h后观察结果,测定抑菌圈直径[12]。

1.2.3.3 蓝莓皮渣花色苷最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用液体稀释法测定取18支试管,分三组。配制细菌液体培养基,将液体培养基和试管分别在121 ℃灭菌20 min。冷却后,试管中各加入1 mL液体培养基,每种菌的第一支试管加入1 mL抑菌液,按照两倍稀释法,将抑菌液配成不同的浓度。每组试管中各加入对应实验菌0.1 mL,摇匀。将试管置入37 ℃恒温培养箱中培养24 h,观察细菌生长情况[12]。

1.2.4 蓝莓皮渣花色苷抑制癌细胞增殖作用的测定

1.2.4.1 溶液的配制以及细胞的培养 根据细胞实验的要求分别配制以下溶液:MTT 溶液(准确称取50 mg MTT 溶解于配制好的PBS 缓冲液中);胎牛血清(将胎牛血清瓶在56 ℃水浴锅中灭活30 min后分装);细胞培养液(改良型1640培养基过0.22 μm滤菌膜,并加入10%已灭活的胎牛血清以及0.1% 青链霉素混合液)。从-80 ℃冷柜中取出结肠癌细胞、胃癌细胞和肝癌细胞,首先将细胞复苏,再进行细胞培养和细胞传代,所有操作在超净工作台中进行,并且严格按照无菌操作规范进行操作,防止细胞染菌[13]。

1.2.4.2 蓝莓皮渣花色苷对癌细胞抑制率的测定 将处于对数期的三种癌细胞按照传代的方法制成细胞悬液,经胰蛋白酶消化后,用培养基稀释成1×105个/mL。在96孔板的每孔中加入100 μL 的细胞悬液,置于37 ℃的CO2培养箱中培养24 h。再取出孔板,每个细胞设置5个药物浓度组以及一个空白组,培养24 h。培养时间到后,每孔中加入10 μL MTT,37 ℃的CO2培养箱中培养4 h。培养时间到后,移液枪移去上清液,加入150 mL DMSO溶液,振荡10 min,用酶标仪测定吸光值。并按下式计算抑制率:

癌细胞抑制率(%)=(1-实验组抑制率/空白组抑制率)×100

式(2)

表1 花色苷对细菌的抑菌效果(以抑菌圈直径表示,mm)Table 1 Antibacterial activity of anthocyanin from blueberry pomace(Diameters of inhibition zone,mm)

注：数值=平均值±标准误差,采用单因素方差分析法(ONE-WAY ANOVA 法)进行比较,行中相同字母表示差异不显著,列中相同数量“*”表示差异不显著,检验的显著性水平为p=0. 05。

表2 蓝莓皮渣花色苷抑菌的MICTable 2 The MIC of anthocyanin from blueberry pomace

注：-表示无细菌生长,溶液澄清;+表示有细菌生长,溶液稍见浑浊;++表示有细菌生长,溶液很浑浊。

2 结果与讨论

2.1 蓝莓皮渣花色苷的液相色谱

从图1 的保留时间判断峰4可能是矢车菊素-3-葡萄糖苷,峰5可能是矢车菊素-3-芸香糖苷,峰7可能是芍药-3-葡萄糖苷。由于缺少其他峰的标准品,因此无法对其他组分进行定性分析。综合分析,蓝莓皮渣花色苷中芍药-3-葡萄糖苷含量相对较高,芍药-3-葡萄糖苷占了总花色苷含量的21.75%,为3.55 mg·g-1。矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷分别占了总花色苷含量的9.05%和7.29%,为1.477和1.19 mg·g-1。有学者发现,通过高效液相和质谱分析蓝莓花色苷有10～17种花色苷单体[14-16],且其主要成分大约有矢车菊素-3-芸香糖苷、芍药-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-葡萄糖苷等[16]。

图1 蓝莓皮渣花色苷高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of anthocyanin from blueberry pomace注:a是标准品在高效液相色谱上的洗脱曲线,b是样品在高效液相色谱上的洗脱曲线;a图中,按照出峰时间先后,三个峰分别是矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷、芍药-3-葡萄糖苷。

2.2 蓝莓皮渣花色苷的抑菌效果

蓝莓皮渣花色苷对3种细菌的抑菌圈大小测定结果见图2和表1。由图2和表1可知,不同浓度的蓝莓皮渣花色苷对3种细菌均有不同程度的抑制效果,且抑制效果随样品剂量增加而不同程度的增加,表明其抑菌效果不断增强,同时蓝莓皮渣花色苷对实验菌均有不同程度的抑制作用。由表2可得,蓝莓皮渣花色苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最低抑制浓度分别为1.25、0.63、0.63 mg/mL,可知蓝莓皮渣花色苷对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的效果要好于气单胞菌。韩永斌[17]等通过紫薯花色苷抑菌实验研究发现,紫薯花色苷对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有良好的抑菌效果,且其抑菌作用与花色苷浓度成正比,与本实验结果相似。这些结果表明花色苷物质对许多微生物具有不同程度的抑菌活性。文献[18]表明花色苷的抑菌作用可能是通过增强细胞膜的通透性,使细胞异常生长,以及改变蛋白质的结构、抑制微生物的呼吸代谢、影响核酸合成等途径[19-20],从而抑制细菌生长。

图2 蓝莓皮渣花色苷抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of anthocyanins from anthocyanin from blueberry pomace注:1:无菌水;2,5,7:1 mg/mL花色苷;3,6,9:2 mg/mL 花色苷;4,8,10:4 mg/mL花色苷。

2.3 蓝莓皮渣花色苷抑制癌细胞增殖作用

本实验采用MTT法对不同浓度的蓝莓皮渣花色苷作用下细胞24 h的增殖抑制率进行了测定。图3分别表示结肠癌、胃癌、肝癌细胞加药后分别培养24 h后的抑制率图。从图3中可以看出,蓝莓皮渣花色苷对结肠癌、胃癌、肝癌细胞增殖都有一定的抑制作用,随着样品质量浓度的增加,抑制率也随之升高。根据抑制率曲线计算蓝莓皮渣花色苷抑制结肠癌、胃癌、肝癌的IC50分别7.54,13.34,21.05 μg/mL。

图3 蓝莓皮渣花色苷对癌细胞的抑制率Fig.3 The inhibition rate of anthocyanin on cancer cell

Giudice A[21]等研究发现花色苷可以诱导II相解毒酶,如UGT、GST、NAD(P)H和抗氧化酶解除致癌物的毒性,从而发挥抗细胞损伤和致癌的化学预防效应。曾林钗等人[23]研究发现矢车菊素-3-葡萄糖苷可抑制裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的生长,其抑制机理可能是通过抑制Mucin-4蛋白表达而抑制癌细胞的生长,从而达到抗癌的目的。国内外研究报告表明,花色苷可以通过抗氧化、激活II相解毒酶、抑制蛋白表达、诱导细胞凋零等方式抑制癌细胞的生长增殖,从而达到抗癌的目的。本实验结果表明,蓝莓皮渣中的花色苷在一定程度上可以抑制癌细胞的增长繁殖,其中对结肠癌细胞的抑制效果最好,胃癌细胞次之,肝癌最差。

3 结论

蓝莓皮渣花色苷含有10种组分,其中3种分别是矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷和芍药-3-葡萄糖苷,三者分别占蓝莓皮渣总花色苷含量的21.75%、9.05%和7.29%。通过牛津杯法进行抑菌性实验,结果表明,花色苷对枯草芽孢杆菌的抑制作用最好,不仅抑菌圈直径大,其MIC也低,为0.63 mg/mL;对金黄色葡糖球菌也有较好的抑制作用,其MIC为0.63 mg/mL;对大肠杆菌的抑菌效果也很明显,其MIC为1.25 mg/mL。综合考虑,蓝莓皮渣花色苷对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好,其次为金黄色葡萄球菌,最后为大肠杆菌。通过MTT实验结果表明蓝莓皮渣花色苷对结肠癌、胃癌、肝癌细胞的增殖都有一定的抑制作用,蓝莓皮渣花色苷对三种癌细胞的抑制效果为结肠癌细胞最好,胃癌细胞次之,肝癌最差。抑制结肠癌、胃癌、肝癌的IC50分别7.54,13.34,21.05 μg/mL。

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Study on tumor suppression and antibacterial effect of anthocyanin from blueberry pomace

CHEN Ke-fei,WANG Hong-fei*,WANG Chun-xing,XIONG Qian, SONG Jia-min,CHENG You-sheng,XU Feng

(Department of Food Science and Engineering,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Anthocyanins were extracted by ethanol from blueberry pomace. The anthocyanin compositions in blueberry pomace were isolated using high performance liquid chromatography(HPLC).Oxford cup assay was performed to determine the antibacterial effects of anthocyanins usingEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandBacillussubtilisas the representatives of the three types of bacteria. The antibacterial spectrum of blueberry pomace-derived anthocyanins was preliminarily identified,and the minimum inhibitory concentration was confirmed by sequential 2-fold dilution. Anti-proliferation activity of anthocyanins at different concentrations against colorectal cancer,gastric cancer and hepatic carcinoma cells were determined by MTT assay. Anthocyanins inhibited the three types of bacteria,with MIC values of 0.63,0.63,1.25 mg/mL,forBacillussubtilis,StaphylococcusaureusandEscherichiacoli,respectively. Blueberry pomace-derived anthocyanins also inhibited all three types of cancer cells,with IC50values of 7.54,13.34,21.05 μg/mL for colorectal cancer,gastric cancer,and liver cancer cells,respectively. Blueberry pomace derived anthocyanins have certain antibacterial and anticancer activity,and the study has important theoretical and practical significance to reveal mechanism of developing new anticancer drugs.

blueberry pomace;anthocyanin;tumors;antibacterial effect

2016-11-17

陈柯斐(1997-),女,本科生,研究方向:农产品贮藏加工,E-mail:2021521738@qq.com。

*通讯作者:王鸿飞(1964-),男,硕士,教授,研究方向:农产品加工与贮藏,E-mail:wanghongfei@nbu.edu.cn。

浙江省自然科学基金(LY16C200003)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)11-0348-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.059