赵 刚,卢虹竹,伊鲁东,顾佳丽,*,李学鹏,励建荣,*

(1.渤海大学化学化工学院,辽宁锦州 121013;2.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013)



响应面优化超声提取-原子吸收光谱法测定贝类中铅的含量

赵 刚1,2,卢虹竹1,伊鲁东1,顾佳丽1,2,*,李学鹏2,励建荣2,*

(1.渤海大学化学化工学院,辽宁锦州 121013;2.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013)

在单因素实验基础上,采用Plackett-Burman筛选和中心组合设计实验筛选优化了超声时间、硝酸浓度和混酸体积三个因素对超声提取贝类中铅的影响。由响应面法建立二次回归模型得到最佳超声条件为:超声提取时间29 min,温度40 ℃,功率320 W,混酸HNO3(2.5 mol/L)-H2O2(3 mol/L)8.10 mL,铅的提取率最高为93.0 %。方法的相对标准偏差(RSD)为5.83%,检出限为0.65 μg/L,定量限为2.1 μg/L。t检验结果表明超声提取法与湿消解法之间不存在显著性差异。超声提取法简便、温和安全且适用于贻贝等贝类样品中铅的提取。

超声提取法,铅,贝类,响应面优化

贝类味道鲜美、营养丰富,是深受百姓喜爱的海产品之一。但受生活环境和摄食习惯等因素影响,贝类易于吸收和积累铅、镉等重金属,并通过食物链转移至人体，危害人类健康[1-5]。贝类中重金属的测定方法有原子吸收光谱法[6]、电感耦合等离子体原子发射光谱法[7]和分光光度法[8]等。通常需要将样品消解,常采用的消解方法有湿式消解法[9]、干法灰化[10]和微波消解法[11]等,但这些方法要求浓酸、高温高压,且消解时间较长[12-13]。超声辅助提取法利用超声波辐射压强产生的强烈空化、机械搅动和击碎等多级效应,增强溶剂穿透力,加速目标成分进入溶剂,缩短了操作时间[14-15]。本文通过Plackett-Burman设计和响应面筛选优化了超声提取贝类中铅的条件,如超声时间、温度、功率、提取剂种类、浓度和体积等,建立了一种更为简便快速、安全且适用于贝类中铅的前处理方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

毛蚶、文哈、扇贝、牡蛎、竹蛏 市售;超纯水;硝酸、高氯酸、30 %过氧化氢 优级纯;铅标准溶液 浓度为1000 μg/mL，中国计量科学研究院;贻贝标准物质(GBW08571) 国家标准物质研究中心;所用玻璃及聚乙烯仪器均用硝酸溶液(1+9)浸泡24 h,超纯水冲洗,晾干后备用。

AA320N型原子吸收分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;80-2型电动离心机 江苏恒丰仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 取新鲜贻贝样品用流水和超纯水冲洗干净,晾干,用不锈钢刀剥去外壳,取软组织,滤纸吸干水分,搅拌机匀浆,称重,于烘箱中80 ℃干燥48 h以上至恒重,放干燥器中冷却,干样用玛瑙研钵研碎成粉,过100目筛,于聚乙烯袋中-20 ℃保存备用[16]。

1.2.2 超声提取法 取0.1 g样品于聚四氟乙烯离心管中,加混酸超声提取,以3000 r/min离心10 min,取上层清液用超纯水定容至25 mL,同时做空白实验。

1.2.3 湿式消解法 依据GB/T 5009.12-2010 食品安全国家标准 食品中铅的测定[17]。

1.2.4 Pb标准溶液配制方法 吸取1 g/L Pb标准溶液用0.5 mol/L硝酸逐级稀释成1、5、10、20、40、60、80、100 μg/L的Pb标准工作液。

试验室从取土场取样对填料密度、天然含水量、液塑限、最大干密度、CBR值等指标进行测定，进行各种剂量石灰土的标准击实试验，并报监理工程师认可。批准的试验数据为：标准击实最大干密度1.696g/cm3，最佳含水量为15.3%。

1.2.5 铅含量的测定 采用石墨炉原子吸收光谱法测定铅的含量,仪器工作条件:波长283.3 nm,狭缝0.7 nm,灯电流10 mA,干燥温度120 ℃,时间10/15 s,灰化温度800 ℃,时间15/15 s,原子化温度1800 ℃,时间5/5 s,高温清洗温度1900 ℃,时间5/3 s。

1.3 实验设计

1.3.1 单因素实验 考察超声时间、超声温度、超声功率、提取剂、硝酸浓度、过氧化氢浓度和混酸体积7个因素对贻贝中铅提取率的影响,获得单因素影响规律及最佳值。固定其中5个因素,分别变化另1个因素进行实验,因素变化范围如下,超声提取时间:5、10、15、20、25、30 min;超声提取温度:30、40、50、60、70、80 ℃;超声功率:160、200、240、280、320、360 W;提取剂为:HNO3和HNO3-H2O2、HNO3-HClO4;硝酸浓度:0.1、0.5、1、3、5、7、9 mol/L;过氧化氢浓度:1、3、5、7、9 mol/L;混酸体积:2、4、6、8、10、12 mL。

1.3.2 Plackett-Burman实验设计 以单因素实验最佳条件为Plackett-Burman实验设计的中心点,实验设计的因素和水平见表1,利用Plackett-Burman设计实验筛选影响贻贝中铅提取率的重要因素。选择6因子实验次数N=12的设计方案,用A、B、C、E、F、G分别代表超声时间、超声温度、超声功率、硝酸浓度、过氧化氢浓度和混酸体积,同时设D一列虚拟变量以考察实验误差。每个因素取高低2个水平[18]。

表1 Plackett-Burman实验设计因素及水平Table 1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

1.3.3 最陡爬坡实验 通过最陡爬坡实验使重要因素的取值逼近最佳区域,建立有效的响应面拟合方程。根据Plackett-Burman实验得一次拟合方程,设计各重要因素的爬坡方向和步长,确定各重要因素的最佳取值[19]。

1.3.4 中心组合设计和响应面分析 采用中心组合设计(Box-Behnken Design,BBD)对筛选出的影响铅提取率的重要因素和水平进一步优化,实验设计的因素和水平见表2。对数据进行二次多项式回归拟合,建立自变量数学模型,并结合方差分析、各因素水平及其交互作用评价结果,预测铅最佳提取条件,最后根据回归方程绘制响应面分析图[20]。

表2 BBD的因素和水平Table 2 Factors and levels of BBD

1.3.5 数据分析 利用Design-Expert.V8.0.6软件进行Plackett-Burman实验设计和BBD响应面分析。

1.4 贻贝中铅提取率的计算

铅提取率(%)=超声提取法测定铅含量/贻贝标准物质(GBW08571)铅含量×100

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

Pb提取率随着超声时间增加而增大,当超声20 min时Pb提取率最大,再增加超声时间对Pb提取率影响较小;超声温度越高,对空化的产生越有利,但是当温度过高时,微气泡中表面张力降低,蒸汽压增大,进而导致气泡闭合时增强了缓冲作用而使空化作用减弱。当超声温度为40 ℃时Pb提取率达到最大;样品经HNO3处理后,Pb提取率较低,说明样品中的有机物不能被HNO3完全氧化,通常需要氧化剂如H2O2等;硝酸浓度越大铅的提取率越高,但考虑硝酸浓度对石墨管的影响,本实验选择硝酸浓度为3 mol/L;溶剂用量过大,会增加成本,甚至造成浪费,溶剂用量过少,Pb提取不完全,影响提取率,Pb达到最大提取量时需要混酸8 mL;超声功率对Pb提取率影响较小,本实验选择超声功率320 W。

表3 Plackett-Burman实验设计及结果Table 3 Plackett-Burman design matrix and corresponding results

最终选择单因素最佳实验条件为:超声提取时间20 min,超声提取温度40 ℃,超声功率320 W,提取剂HNO3-H2O2,硝酸浓度3 mol/L,过氧化氢浓度3 mol/L,混酸体积8 mL。

2.2 Plackett-Burman实验结果

表4 Plackett-Burman实验方差分析Table 4 Analysis of variance for Plackett-Burman

在几个影响因素中,A(超声时间)、E(硝酸浓度)和G(混酸体积)对铅提取率影响显著(p<0.05),其它因素影响不显著。在后续响应面实验中重点考察这四个因素的最佳取值,其它条件采用单因素最佳条件:超声温度40 ℃、超声功率320 W、H2O2浓度2 mol/L。

2.3 最陡爬坡实验结果

由PB实验的回归方程中三个重要因素的变量关系确定爬坡方向和步长。其中A(超声时间)、E(硝酸浓度)和G(混酸体积)为正效应。表5为最陡爬坡实验设计及结果。结果表明最优提取条件可能出现在实验3中,因此以实验3的条件作为后续BBD实验的中心点。

表5 最陡爬坡实验设计及结果Table 5 Steepest ascent design and corresponding results

2.4 BBD实验及响应面分析

2.4.1 回归模型的建立 根据BBD原理设计3因素3水平共12组实验,表5为自变量因素和水平,表6为实验设计及结果。对表6实验数据进行回归拟合,得到3个自变量的二次多项回归方程:铅提取率Y=93.95+12.06A-8.31B-5.43C-7.78AB+2.30AC-11.35BC-16.89A2-27.19B2-18.67C2。

表6 BBD设计与结果Table 6 BBD design and results

表7 BBD方差分析Table 7 Analysis of variance for BBD

2.4.2 响应面分析及优化 根据回归方程进行响应面分析,确定3个因素及其交互作用对铅提取率的影响。由于交互项AB、BC交互作用显著,因此仅对其进行分析,响应面曲面如图1所示。响应面坡度越陡峭说明此因素对响应值影响越显著[21]。如图1-a可见,混酸体积处于零水平时,在一定的硝酸浓度下,铅提取率随超声时间的增加呈先增大后趋于平缓的趋势;在一定的超声时间下,铅提取率随硝酸浓度的增大呈先增大后减小的趋势。因此可知,在较高的超声时间和适中的硝酸浓度的交互作用下,铅提取率可达到最大值[22]。如图1-b可见,超声时间处于零水平时,在一定的混酸体积下,铅提取率随硝酸浓度的增大呈先增大后减少;在一定的硝酸浓度下,铅提取率随混酸体积的增大呈先增大后减小的趋势。因此可知,在适中的超硝酸浓度和粒径的交互作用下,铅提取率可达到最大值。

图1 各因素交互作用的响应面图Fig.1 Response surface plots for the pairwise interactive effects of the factors

利用软件预测得最佳提取条件为:超声时间23.99 min,硝酸浓度2.61 mol/L,混酸7.76 mL,铅提取率理论值为97.3461%。根据上述最佳条件并考虑实际操作可行性适当修正为:超声时间29 min,硝酸浓度2.5 mol/L,混酸8.10 mL进行验证实验,取平行三次实验结果平均值,以验证模型可靠性。铅提取率实验值为93.0 %,与预测值基本一致,说明该模型有效,用该模型分析和预测贝类中铅的超声提取工艺是合适的。

2.5 方法验证

2.5.1 方法的线性范围、检出限和定量限 采用石墨炉原子吸收光谱法测定铅标准系列溶液的吸光度,标准曲线方程为y=0.0249x-0.0471,线性范围为1～100 μg/L,相关系数为0.9986。平行11次测定空白溶液,用3倍的标准偏差除以标准曲线斜率计算检出限为0.65 μg/L,以10倍的标准偏差除以标准曲线斜率计算定量限为2.1 μg/L。

2.5.2 方法的精密度与准确度 分别用超声提取法(最佳条件)和湿式消解法处理样品,用原子吸收光谱法平行6次测定贻贝标准物质(GBW08571)中铅的含量,实验结果见表8。由表8可见,两种预处理方法的测定值均在标准值的不确定范围内,相对标准偏差(RSD)<10%。

t检验结果表明,在置信度P为90%时,计算t=1.68小于t0.10,5=2.02,这表明超声提取法与湿消解法(国标法)之间不存在显著性差异。

表8 两种预处理方法的比较(mg/kg)Table 8 Comparisons of different pretreatment methods(mg/kg)

表10 常见贝类中铅的含量(mg/kg)Table 10 The content of lead in shellfish

注:a平均值±标准偏差,n=5。

2.5.3 加标回收实验 为考察标准溶液与样品基质浓度是否一致以及样品溶液背景等干扰情况,进行加标回收实验,即将样品经超声提取后,加入一定量的标准溶液,测定溶液中Pb的含量,计算加标回收率在93%～103%之间(表9),说明此标准溶液系列用于样品中Pb含量的测定可行。

表9 加标回收率Table 9 The recovery rate

注:a由干样换算成湿样数据。

2.6 样品的测定

取市售新鲜贝类,按样品预处理方法制备成干粉后,在最佳超声提取条件下,测定贝类样品中铅的含量,结果见表10。

3 结论

在最佳条件下,超声提取法可以定量提取贝类中的Pb,且结果与国标经典方法-湿消解法相比基本一致,但超声提取法缩短了消解法加热、冷却和赶酸等步骤的时间,也减少了NO2等有毒气体的排放,因此方法更为简便快速、试剂用量少、污染少、残渣少且安全性较好,为贝类中重金属的测定提供了一个可供选择的预处理方法。

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Determination of lead in shellfish by ultrasound assisted extraction-atomic absorption spectrometry with response surface method

ZHAO Gang1,2,LU Hong-zhu1,YI Lu-dong1,GU Jia-li1,2,*,LI Xue-peng2,LI Jian-rong2,*

(1.School of Chemistry & Chemical Engineering,Bohai University,Jinzhou 121013,China; 2.College of Food Science and Technology of Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province, National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China)

The optimized extraction conditions of lead in shellfish were obtained by Plackett-Burman design and response surface methodology on the basis of single factor experiment. The results indicated that the extraction rate of lead was 93.0% when ultrasonic extraction time was 29 min,ultrasonic temperature was 40 ℃,ultrasonic power was 320 W,HNO3(2.5 mol/L)-H2O2(3 mol/L)8.10 mL. The relative standard deviation was 5.83%,the limit of detection was 0.65 μg/L,limit of quantity was 2.1 μg/L. The results of t test showed that there was no significant difference between the ultrasound assisted extraction and wet digestion method. The ultrasonic extraction is more convenient,safer and can also be applied to determination of lead in shellfish.

ultrasound assisted extraction;lead;shellfish;response surface method

2016-11-01

赵刚(1979-),男,博士,讲师,研究方向:分离富集、食品分析和食品安全，E-mail:147877708@qq.com。

*通讯作者:顾佳丽(1980-),女,硕士,副教授,硕士生导师,研究方向:重金属分析,E-mail:gujiali_99@163.com。 励建荣(1964-),男,博士,教授,研究方向:水产品贮藏加工、食品安全,E-mail:lijr6491@163.com。

“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD29B06);辽宁省高等学校攀登学者支持计划“辽西地产特色资源开发与利用” 辽教发[2011]134号;2016年国家级大学生创新创业项目(201610167078)。

TS254.1

B

1002-0306(2017)11-0195-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.028