丁 城,周梦舟,关亚飞,吴 茜,*

(1.湖北工业大学生物工程与食品学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉 430068;2.武汉市华测检测技术有限公司,湖北武汉 430068)



原花青素对Glu-Asn体系中丙烯酰胺的抑制作用研究

丁 城1,周梦舟1,关亚飞2,吴 茜1,*

(1.湖北工业大学生物工程与食品学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉 430068;2.武汉市华测检测技术有限公司,湖北武汉 430068)

本文选取荔枝原花青素(LPPC)和莲房原花青素(LSPC)进行丙烯酰胺抑制作用的研究。实验发现两种原花青素的浓度-抑制率关系均呈非线性关系,当LPPC和LSPC的添加量分别0.5 mg·mL-1和0.1 mg·mL-1时,丙烯酰胺的抑制率达到最大,分别为53.01%±5.62%和76.60%±3.20%;同时也探讨了体系中抗氧化性、色度和类黑精含量与抑制率的关系。结果表明体系抗氧化性越大,丙烯酰胺的抑制率就越高;白度越大,丙烯酰胺抑制率就越大;类黑精含量越大,丙烯酰胺的抑制率反而越低。总体来说,原花青素能显著地抑制丙烯酰胺的形成。

原花青素,荔枝原花青素,莲房原花青素,丙烯酰胺

1994年,国际癌症研究署(International Agency for Research on Cancer,IARC)就将丙烯酰胺列为2A组“人类可能的致癌物”[1]。丙烯酰胺具有较强的渗透性,可通过呼吸道、消化道以及皮肤和黏膜等快速进入人体内引起中毒[2]。动物实验和长期暴露量实验表明,它主要具有神经毒性[3]、生殖毒性[4]、遗传毒性[5]以及致畸性等。

国际上关于丙烯酰胺的抑制方法,已经有了较为系统的研究。Pedreschi等发现薯条在热烫之前于1.0%的食盐溶液中浸泡可显著的降低丙烯酰胺含量[6];Cheng等探讨了六种水果(苹果、蓝莓、山竹、龙眼、白心火龙果和红心火龙果)提取物对Glu-Asn体系中丙烯酰胺的形成的影响,发现苹果提取物能显著抑制丙烯酰胺的形成[7];Kotsiou等人发现在Glu-Asn体系中添加牛至酚酸提取物可以降低49%的丙烯酰胺含量,而橄榄油酚酸提取物增加了48%的丙烯酰胺含量[8];此外,Zhang的研究证实了属于天然产物提取物的竹叶黄酮和绿茶提取物能够显著的降低Glu-Asn体系中丙烯酰胺的形成[9]。

19世纪末人们研究发现许多高等植物的叶、果、花内的无色物质在酸作用下生成红色的产物,从而解开了原花青素的研究序幕。凌智群等人发现莲房原花青素(procyanidin of lotus seedpod,LSPC)和荔枝原花青素(procyanidin of litchi pericarp,LPPC)为成熟的莲房花托和荔枝皮中主要成分,并且成功将其分离。从中分离了莲房原花青素(procyanidin of lotus seedpod,LSPC)和荔枝原花青素(procyanidin of litchi pericarp,LPPC)为它们的主要成分,同时证明了它们具有抗氧化、免疫调节等多种生理功能[10-11]。

LSPC和LPPC对丙烯酰胺的抑制作用并无报道,因此,本文以LSPC和LPPC为研究对象,探讨原花青素对丙烯酰胺的抑制作用,结合浓度—抑制率关系,确定最佳添加剂量水平,然而美拉德反应中的产物类黑精与丙烯酰胺的生成具有一定关系,因此本文也研究抗氧化性、类黑精含量以及色度与抑制率的关系和原花青素对体系丙烯酰胺生成的抑制作用。

1 材料与方法

荔枝原花青素(99.56%)和莲房原花青素(100.89%,以标准品葡萄籽原花青素浓度为参照,用盐酸正丁醇法测定荔枝原花青素和莲房原花青素含量) 实验室自己提取;丙烯酰胺标准品(>99.9%) 德国Dr.E公司;D-(±)-水合葡萄糖、L-水合天门冬酰胺、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、亚铁氰化钾、硫酸锌、正己烷:国药集团化学试剂有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、2,4,6-三(2-吡啶基)-S-三嗪(TPTZ) 美国Sigma公司;竹叶抗氧化物 浙江大学生物工程和食品科学学院提供 岛津LC-20AT高效液相色谱仪 日本岛津公司;SupercleanTMENVITM-18固相萃取小柱(3 mL:美国Superclean公司;Waters Atlantis® T3色谱柱 美国Waters公司;0.22 μm水系针筒式微孔滤膜过滤器:上海楚柏实验室设备有限公司;Milli-Q水纯化系统 法国Millipore公司;CR-400色彩色差计 日本柯尼卡美能达公司;UV-2000型紫外-可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 荔枝原花青素和莲房原花青素提取 参考文献[12-13],荔枝原花青素:将粉碎后的荔枝皮,按照料液比1∶20(w/v)加入80%乙醇,在温度50 ℃下,提取120 min,提取3次,将提取液过滤后,用旋转蒸发仪减压回收乙醇;莲房原花青素:将粉碎后的莲房,加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应,然后用65%乙醇,在55 ℃下,提取120 min,抽滤得提取液,在50 ℃下,用旋转蒸发仪将乙醇蒸出。

1.2.2 葡萄糖-天门冬酰胺(Glu-Asn)模拟体系的建立 配制pH8.0的0.1 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液(Na2HPO4∶NaH2PO4=94.7∶5.3),继续用缓冲液分别配制0.2 mol·L-1的Asn溶液和0.2 mol·L-1的Glu溶液置于4 ℃冰箱备用。采用逐级稀释法用缓冲液分别配制浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg·mL-1的荔枝原花青素(LPPC)和莲房原花青素(LSPC)水溶液置于4 ℃冰箱备用,同时配制0.02 mg·mL-1的AOB溶液于4 ℃冰箱备用。向不锈钢密封试管中分别加入500 μL Asn溶液和500 μL Glu溶液构成0.1 mol·L-1等摩尔比的Glu-Asn模拟体系,设置空白对照组和原花青素实验组,在实验组向体系中分别加入相应浓度的原花青素溶液,在对照组中加入相同体积的缓冲液,密封置入180 ℃恒温油浴锅中反应30 min后取出,迅速置于冰浴阻止其继续反应,各实验重复三次。将反应产物补足至10 mL,置于离心管中于4 ℃、11000 r/min下离心20 min,取2 mL上层清液过固相萃取柱(固相萃取柱事先用2 mL甲醇与2 mL水进行活化),弃去前2 mL收集后3 mL,过0.22 μm滤膜后进行高效液相色谱的测定,测条件为:流动相为甲醇∶0.1%甲酸水溶液=5∶95,流速1.0 mL·min-1,柱温:30 ℃,检测波长:205 nm。

1.2.3 模拟体系终产物的抗氧化性的测定

1.2.3.1 DPPH法测定抗氧化性 根据实验所设计的浓度加入适量的Trolox溶液,用水补足至1 mL,在各试管中加入4 mL的DPPH·(50 mg·L-1,甲醇溶解)溶液,涡旋混匀后静置1 h,于520 nm波长下测定吸光度,建立标准曲线,线性范围为0～0.4 mmol·L-1。样品测定时,准确量取0.2 mL样液测定,空白组加入等量的水溶液。以Trolox等价抗氧化能力(TEAC)来表示反应终产物清除DPPH·的能力,μmol trolox/mL。

接车后，首先询问车主，得知该车为偶发性故障，曾经在一家修理厂更换过点火线圈、火花塞，曾经还因为漏油拆卸过发动机进行漏油处理。此故障多发生在正常行驶过程中，在更换点火线圈、火花塞后有所好转，但时间不长，又会出现发动机抖动、加速无力的现象，且发动机故障灯被点亮。

1.2.3.2 FRAP法测定抗氧化性 配制40 mmol·L-1的盐酸溶液、10 mmol·L-1的TPTZ溶液和300 mmol·L-1的醋酸盐缓冲溶液(3.1 g冰醋酸纳加16 mL冰醋酸加水定容至1 L)。向烧杯中依次加入上述三种溶液,体积比为1∶1∶10,配制成铁离子还原能力(FRAP)反应液备用。根据实验所设计的浓度加入适量的Trolox溶液,用水补足至0.5 mL,加入4.5 mL反应液涡旋静置2 h,于595 nm波长下检测吸光度,建立标准曲线,线性范围为0～0.2 mmol·L-1。样品测定时,准确量取50 μL样液测定,空白组加入等量的水溶液。以Trolox等价抗氧化能力(TEAC)来表示反应终产物的铁还原能力,μmol trolox/mL。

1.2.3.3 ABTS法测定抗氧化性 配制7 mmol·L-1的ABTS和2.45 mmol·L-1的高硫酸钾混合贮液,室温黑暗中放置12～16 h,使ABTS+·达到氧化稳定状态。根据实验所设计的浓度加入适量的Trolox溶液,用水补足至1 mL,加入4 mL反应液涡旋静置20 min,于730 nm波长下检测吸光度,建立标准曲线,线性范围为0～0.2 mmol·L-1。样品测定时,准确量取0.1 mL样液测定,空白组加入等量的水溶液。以Trolox等价抗氧化能力(TEAC)来表示反应终产物清除ABTS+·能力,μmol Trolox/mL。

1.2.4 模拟体系终产物色度的测定 将反应产物定容至10 mL,取一定量装入石英比色皿,密封至无气泡。以A4白纸作为本底,将比色皿水平放置,手持色差计垂直测定,记下L*、a*、b*值,并通过下述公式计算白度(WI)。每组实验重复三次。

1.2.5 模拟体系终产物类黑精含量的测定 将反应产物用水稀释10倍后,采用紫外分光光度计在470 nm下测定吸光度,通过Lambert-Beer定律计算样品中类黑精的含量,其中类黑精的比例系数取282 L·mol-1·cm-1[14]。每组实验重复三次。

其中:C:类黑精的含量(mmol·L-1)A:吸光度;V:样品定容体积(mL);E:类黑精的摩尔消光系数(282 L·mol-1·cm-1);b:比色皿宽度(cm)。

1.3 统计学分析

2 结果与分析

2.1 原花青素抑制Glu-Asn体系中丙烯酰胺的量效关系

将100 μL的各浓度原花青素溶液加入到1.0 mL体系中,故原花青素最终反应浓度为实验设计添加浓度的1/10。LSPC和LPPC对Glu-Asn体系中丙烯酰胺的浓度-抑制关系如图1所示。结果表明:2种原花青素对丙烯酰胺的浓度-抑制率均呈非线性变化,这可能的一种原因是原花青素作为一种天然提取物,在长时间高温加热过程中本身的性质也会发生变化,使其抑制作用发生改变[15];还有一种原因是原花青素作为一种抗氧化剂,其也符合抗氧化悖论,即浓度增大到一定程度时,抗氧化能力反而减小,因此对丙烯酰胺的抑制能力也随之减小[16]。实验中阳性对照物AOB(竹叶抗氧化物)能够有效的抑制丙烯酰胺的产生[9],且与原花青素以及对照组均存在显著性差异。抑制率如图2所示,当LSPC添加浓度为0.1 mg·mL-1时,抑制率达到最大,为76.60%±3.20%;LPPC添加浓度为0.5 mg·mL-1时,抑制率达到最大,为53.01%±5.62%。

图1 体系中丙烯酰胺的含量与LPPC和LSPC添加量的关系(n=3)Fig.1 Contents of acrylamide in reaction system by different addition levels of LPPC and LSPC(n=3)注:Con为空白对照组;PC为阳性对照组,不同的字母代表显著性差异,p<0.05，图6同。

图2 体系中丙烯酰胺的抑制率与LPPC和LSPC添加量的关系(n=3)Fig.2 Inhibition ratio of acrylamide in reaction system by different addition levels of LPPC and LSPC(n=3)

2.2 原花青素对丙烯酰胺的抑制作用与体系中抗氧化性的关系

选取三种方法测定体系中的抗氧化性。评价方法为以相应的空白组的TEAC作为基准,计算2种原花青素在不同的添加剂量下反应终产物TEAC的差值。三种测定方法的标曲见图3。DPPH·、FRAP、ABTS+·的标准曲线的相关系数均大于0.999。样品的三组抑制率-ΔTEAC关系曲线如图4所示。三种曲线的相关系数(R2)分别为0.8969(抑制率-ΔTEACDPPH)、0.9458(抑制率-ΔTEACFRAP)和0.9213(抑制率-ΔTEACABTS)。FRAP测定方法的相关系数最高,三种方法总体而言差别不大。这说明体系中丙烯酰胺生成量与抗氧性有密切关系,抗氧化性强,有利于原花青素抑制丙烯酰胺产生。从两者的数值关系来看,体系中的抗氧化性降低,丙烯酰胺的抑制率逐渐下降。从反应现象来看,丙烯酰胺在得到抑制的同时,反应体系的颜色变浅,推测可能是美拉德反应中类黑精的含量发生了变化,从而导致体系颜色的变化[17]。

图3 DPPH·、FRAP和ABTS+·标准曲线及其相关系数Fig.3 Standard curve and correlation coefficient of DPPH·，FRAP and ABTS+·

图4 原花青素对丙烯酰胺的抑制作用与模拟体系中抗氧化活性体系的关系Fig.4 Correlation between the effect of procyanidins on the reduction of acrylamide and the antioxidant properties of model注:AA为丙烯酰胺。

2.3 原花青素对丙烯酰胺的抑制作用与体系中色度的关系

表1 Glu-Asn模拟体系中荔枝原花青素添加浓度与色度的关系Table 1 Relationship between concentration of LPPC and chroma in Glu-Asn system

原花青素对丙烯酰胺的抑制作用与色度的关系通过测定值L*、a*、b*和计算出的白度值WI表示,结果如表1(LPPC)和表2(LSPC)所示。实验数值中,L*代表溶液颜色的亮度;a*代表红绿,正值(+)越大,颜色越红,负值(-)越小,颜色越绿;b*代表黄蓝,正值(+)越大,颜色越黄,负值(-)越小,颜色越蓝。随着原花青素浓度的增大,两组实验中,L*值都逐渐变大,颜色越来越亮;a*逐渐减小,颜色由红色慢慢转向绿色;b*值逐渐减小,颜色由黄色慢慢转向蓝色,最终总体上而言,整个溶液的白度慢慢变深,即由深色慢慢转为浅色。

表2 Glu-Asn模拟体系中莲房原花青素添加浓度与色度的关系Table 2 Relationship between concentration of LSPC and chroma in Glu-Asn system

这也从侧面说明了美拉德反应中类黑精含量可能慢慢由高变低(扣除了原花青素颜色值)。当LPPC添加浓度为0.5 mg·mL-1时丙烯酰胺抑制率最大,此时反应体系的白度和空白组有显著性差异(p<0.05),LSPC添加浓度为0.1 mg·mL-1时丙烯酰胺抑制率最大,此时反应体系的白度和空白组也具有显著性差异(p<0.05),结果表明丙烯酰胺的含量对白度有一定影响,体系中丙烯酰胺的含量下降,白度增加。

图5 葡萄糖/天门冬酰胺体系中AA抑制率与白度的关系Fig.5 The relationship between inhibition ratios of acrylamide and WI in Glu/Asn system注：A:LPPC，B:LSPC。

同时由图5可以看出,两组实验中丙烯酰胺抑制率与白度均成一定的线性关系,线性相关系数分别为0.8359(LPPC)和0.9391(LSPC),LSPC组的线性关系要好于LPPC组,两组走势一致,均随着白度增加抑制率变大。

2.4 原花青素对丙烯酰胺的抑制作用与体系中类黑精含量的关系

由图6可以看出:随着两种原花青素添加浓度的增大,体系中类黑精的含量呈降低趋势,LPPC组中0.05、0.5、1.0 mg·mL-1组与对照组有显著性差异(p<0.05),LSPC组中0.1、0.5、1.0 mg·mL-1组与对照组有显著性差异(p<0.05)。同时丙烯酰胺抑制率对类黑精含量的关系曲线如图7所示。2种曲线的相关系数(R2)分别为0.7353和0.8489。

图6 原花青素的添加浓度与模拟体系中类黑精生成量的关系(n=3)Fig.6 Correlation between the concentrations of procyanidins and melanoidins contents in model system(n=3)

图7 原花青素对丙烯酰胺的抑制与模拟体系中类黑精含量之间的关系Fig.7 Correlation between the effect of procyanidins on the reduction of acrylamide and the melanoidins contents in model system注:(A)LPPC-类黑精关系曲线;(B)LSPC-类黑精关系曲线。

3 结论

丙烯酰胺的形成机理主要为还原糖和天门冬酰胺等氨基酸通过美拉德反应(主要是Strecker反应)产生丙烯酰胺,其中Shiff碱(Shiff base):N-葡基胺是作为丙烯酰胺生成的主要前提物质。在形成N-葡基胺的过程中伴随着氧化还原反应的进行,故理论上添加一定量的抗氧化剂可以抑制丙烯酰胺的生成。原花青素属于多酚类物质,其多羟基结构使其具备了很好的抗氧化、抗炎等功效。实验结果表明:丙烯酰胺的生成情况与原花青素的添加含量有着密切的关系。两者的浓度-抑制率关系都为非线性关系,当添加含量在0.001～0.1 mg·mL-1时,丙烯酰胺的抑制率随着LSPC含量的增大而升高,但当继续增加浓度时,丙烯酰胺的抑制率反而变小,LSPC的最大抑制率(76.60%)大于LPPC的最大抑制率(53.01%)。

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Effect of the procyanidins of acrylamide inhibition in glucose-asparagine model system

DING Cheng1,ZHOU Meng-zhou1,GUAN Ya-fei2,WU Qian1，*

(1.Hubei University of Technology,Bioengineering and Food College,Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hhubei,Hubei Uuniversity of Technology,Wuhan 430068,China; 2.Measurement Testing Technology Co.,LTD.,Wuhan 430068,China)

Procyanidin of litchi pericarp(LPPC)and procyanidin of lotus seedpod(LSPC)was chosen to study the inhibition of acrylamide in the model system. The result showed that two kinds of procyanidins concentration-inhibition rate relationships were nonlinear changes. Acrylamide inhibition rate reached the maximum of 53.01%±5.62% and 76.60%±3.20%,when the add amount of LPPC and LSPC were 0.5 mg·mL-1and 0.1 mg·mL-1. At the same time,the relationship between antioxidant systems,color and black fine class content and inhibition rate was also discussed. The stronger the antioxidant activity and whiteness of antioxidant systems,the better the acrylamide inhibition rate. In contrast,the higher the content of melanoidin,while the lower the inhibition rate of crylamide. It can be concluded that procyanidine significantly decreased the incidence of acrylamide.

procyanidin;LPPC;LSPC;acrylamide

2016-10-28

丁城(1991-)，男，硕士研究生，研究方向：食品微生物和发酵，E-mail：chaoren.hg@foxmail.com。

*通讯作者:吴茜(1988-)，女，博士，讲师，研究方向：天然产物及食品生物技术，E-mail：wuqianhugong@163.com。

国家重点研发项目子课题项目(2016YFD0400701-05)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)11-0116-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.014