董建辉++徐晴++周容++盛敏++温亮++龙小玲++樊军++陈明

摘要：氢离子焦磷酸化酶（H+-PPase）是一类H+转运蛋白，它以焦磷酸（PPi）水解底物，水解PPi产生的自由能与H+跨膜转运相藕联，将细胞质中的H+泵入液泡中，建立跨液泡膜电化学梯度，形成质子驱动力，为无机离子及其他溶质进出液泡提供动力，有利于植物维持细胞离子平衡和渗透平衡，增强植物的抗逆性。基于前期对披碱草（Elymus dahuricus）H+-PPase基因EdHP1克隆的基础，对其表达谱及基因功能进行了进一步研究。结果表明，通过Northern blot分析发现，该基因在披碱草中受干旱、低温非生物胁迫诱导表达。通过对转EdHP1基因烟草在干旱、低温环境下的功能分析发现，过表达EdHP1基因可以提高转基因烟草对干旱、冷胁迫的抗性。

关键词：披碱草（Elymus dahuricus）；焦磷酸化酶基因；表达分析；干旱；低温

中图分类号：Q74 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）10-1963-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.041

Functional Analysis of H+-Pyrophosphatase Gene，EdHP1 of Elymus dahuricus

DONG Jian-hui1，XU Qing1，ZHOU Rong1，SHENG Min1，WEN Liang1，LONG Xiao-ling1，FAN Jun1，CHEN Ming2

（1.Hubei Academy of Agriculture Sciences，Wuhan 430064，China；2.Chinese Academy of Agricultural Sciences（CAAS），Beijing 100081，China）

Abstract： H（+）-pyrophosphatase （H+-PPase） is an H+ transporter and taking the pyrophosphate （PPi） as substrate for hydrolysis. The free energy that produced by hydrolysis of pyrophosphate coupled with the trans-membrane transport of the H+ is able to pump the H+ from the cytoplasm into the vacuole，and form the electro-chemical gradient across the tonoplast and the proton motive force to promote the import and export of the inorganic ions and to maintain the ion balance and osmotic potential，finally to enhance the plant tolerance to stress. Based on the H+-PPase gene（EdHP1） had been cloned from E. dahuricus in previous studies，a further analysis of this gene，which including the expression and functional analysis of this gene under various stress conditions were performed in this study. Northern-blot analysis results showed that the expression of EdHP1 was induced by different abiotic stresses such as drought and cold of E. dahuricus. The functional analyses indicated that over-expression of EdHP1 enhanced the tolerance of transgenic tobacco plants to drought and cold in comparison with wild type plants.

Key words： Elymus dahuricus； H+-PPase； expression analysis； drought； cold

焦磷酸化酶（H+-PPase）既是H+转运酶[1]，也是以焦磷酸（pyrophosphate，PPi）为底物的水解酶。该酶普遍存在于植物和少数光合细菌中，是植物液泡膜上的组分，约占膜蛋白的1%～10%[2]，参与合成糖类、核酸和蛋白质等多种代谢途径中所形成的焦磷酸的水解[3]。H+-PPase水解PPi产生自由能与H+跨膜转运相耦联，形成质子驱动力，与H+-ATPase将H+从细胞质泵入液泡中，为离子和其他溶质的次级转运提供动能[4]；还可以建立跨液泡膜电化学梯度，为无机离子及其他溶質出入液泡提供驱动力[5，6]，既可以维持细胞离子平衡和渗透平衡，又能减轻一些无机离子（如Na+和Cl-）对细胞质的毒害；还能使液泡酸化和细胞质碱化，有助于细胞质中生理生化反应的顺利进行。Davies等[7]和Obermeyer等[8]发现H+-PPase还参与K+向液泡内的运输，用膜片钳手段分别检测甜菜（Beta vulgaris）和东亚市藜（Chenopodium rubrum） H+-PPase，结果表明，H+-PPase可能作为H+/K+共向转运蛋白，介导K+向液泡内的运输，其耦联比为1.3H+/1.7K+/1PPi。但这种运输是否是主动运输目前还尚有争议，有些学者在H+-PPase蛋白重组和42K+示踪试验中没有发现K+的运输过程[9]，Ros等[10]用荧光探针法也没有检测到H+-PPase对K+的主动运输。Li等[11]发现拟南芥（Arabidopsis thaliana）H+-PPase（AVP1）除了酸化液泡外，还控制植物生长素的运输，进而影响依赖生长素的各种发育过程。AVP1的过量表达导致植物器官形成时的细胞分裂、增生以及生长素运输加快；相反，avp1-1突变体的根和地上部分发育都受到削弱，生长素运输也变慢，其原因是AVP1基因的表达会影响与生长素分布有关的两种蛋白（三磷酸腺苷酶和生长素外流介体PIN1）的分布和数量。AVP1作用的结果使生长素外流变得更加容易，从而促进根系发育和植株地上部分的生长。目前，从绿藻、拟南芥、大麦[12]等植物中克隆到了H+-PPase基因，功能分析表明，H+-PPase基因的过量表达可以增加转基因植物的耐盐及抗旱性[12]。

披碱草（Elymus dahuricus）是禾本科披碱草属多年生优质牧草，须根发达，具有较强的抗旱、耐盐碱能力。前期从披碱草中克隆了H+-PPase基因EdHP1[13]，并且构建了植物表达载体转化烟草。对该基因的表达模式及其在抗逆性方面进行了分析，结果表明，EdHP1基因的表达受干旱、低温的诱导，过表达EdHP1基因能提高转基因烟草对干旱、低温胁迫等逆境的抗性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 披碱草种子由内蒙古农业大学提供。将披碱草种子4 ℃春化3 d，然后播种在花盆中，取生长3周后的苗子分别进行干旱、ABA（200 μmo1/L）和4 ℃冷处理，处理时间分别为1、2、5、12、24 h，将处理后的苗子在液氮中冷冻后-70 ℃保存备用。

1.1.2 菌种、载体及试剂 表达载体pBI121、E. coli菌株DH5α和亚细胞定位载体163hGFP均为实验室保存。pMD18-T Vector和小量胶回收试剂盒（Gel Extraction Mini Kit）为宝生物工程（大连）有限公司产品，限制性内切酶和T4连接酶购自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 EdHPI基因克隆及生物信息学分析 依据EdHPI基因cDNA序列的5′端和3′端设计引物：EdHPI-R：5′GCTAGGTCTTGACCCTTTCCGATGGC 3′；EdHPI-L：5′GTTACTATGCAAGGTGAAGGAGGTAG3′。提取披碱草RNA，并进行纯化后备用。利用DNAMAN序列分析软件和TMHMM网站（http：//www.cbs.dtu.dk）对EdHPI甚因进行生物信息学分析。

1.2.2 EdHP1基因的Northern blot分析

1）电泳。电泳及转膜用具0.1 mmol/L NaOH浸置过夜，然后用灭菌的0.1%DEPC水冲洗备用。在DEPC水处理过的配胶瓶中加入适量琼脂糖（1.2%的琼脂糖），加热溶解琼脂糖，冷却到55 ℃，加入10×MOPS和甲醛，倒胶备用。将50 μL浓度为20 μg/μL的RNA 55 ℃水浴15 min后，置于在冰上，加入10 μL 5×RNA Loading Buffer，点样。4～5 V/cm电泳，直到溴酚蓝指示剂移出约8 cm，用灭过菌的10×SSC轻轻晃摇15 min去甲醛。

2）转膜。转膜过夜后，卸下转膜装置，用铅笔标记膜号及点样顺序，紫外交聯3 min。

3）探针的制备及标记。根据RT-PCR引物（Primer-F：5′GCTATTGCAAGTAGTCTCCGATTAGG 3′；Primer-R：5′CATCATGATTCTGTCTGCTCCATGCTC3′）。反应程序：94 ℃预变性 3 min；94 ℃ 变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环； 72 ℃延伸10 min，PCR扩增基因片段做探针。探针的标记使用Random Primer DNA Labeling Kit。

4）杂交。将杂交膜先放在水中预湿，将膜卷成筒状，RNA面朝里，避免膜重叠用纱布隔开，放入杂交管中；在杂交管中倒入少量的预杂交液，沿一定方向转动杂交管；倒掉预杂交液再加管预杂交液，65 ℃预杂交30 min；加入标记好的变性探针65 ℃杂交过夜。然后将杂交膜用洗液Ⅰ（2×SSC/0.1%SDS）和洗液Ⅱ洗后放入磷屏中压4～5 d，把杂交膜放在沸腾的0.1%SDS溶液里面10 min，再放到2×SSC溶液中，探测同位素信号直到探测不到信号为止。

1.2.3 表达载体的构建 将pBI121载体用BamHⅠ、SacⅠ进行双酶切，切除GUS基因，插入两端引入BamHⅠ、SacⅠ酶切位点的EdHP1基因，获得植物表达载体，并将该载体转入农杆菌（C58C1）。

1.2.4 EdHP1基因的烟草转化 叶盘法转化烟草[14]。

1.2.5 转EdHP1基因烟草的抗旱、耐低温能力分析

选择生长状态一致的未转基因烟草植株（Wt）和T0代阳性转基因株系（EdHP1）进行无性繁殖，剪成多段带有叶芽没有根的茎秆插MS+2%PEG（干旱处理）的培养基上进行胁迫培养，培养条件是25 ℃，光照培养16 h/暗培养8 h，培养4周后观察植株根及地上部分生长情况。冷处理为生长两周左右的未转基因烟草（Wt）和转基因株系（EdHP1）在-4 ℃处理12 h后，转入正常生长条件下恢复培养1周，观察生长情况，并进行基因的表达分析。

2 结果与分析

2.1 EdHP1基因生物信息学分析

EdHP1基因的开放性阅读框共有2 310 bp，编码氨基酸770个（图1A），蛋白分子质量是80.05 ku，等电点为4.89。在TMHMM网站（http：//www.cbs.dtu.dk）分析蛋白质结构发现EdHP1含有14个跨膜区（图1B），并包含3个保守区：CS1（226-353 aa）、CS2（452-503 aa）和CS3（659-765 aa），其中CS1中的DVGADLVGKVE 氨基酸序列（图1A）可能对EdHP1的催化起关键作用，表明其是一个典型的跨膜蛋白。

将EdHP1基因与其他高等植物的H+-PPase基因对比分析发现，核苷酸和氨基酸序列具有很高的同源性，跨膜区的保守性更高。利用DNAMAN软件对EdHP1全长氨基酸序列开展进化树分析结果显示，EdHP1与大麦（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、拟南芥（A. thaliana）、甜菜（B. vulgaris）、绿豆（Vigna radiata）、小麦（Triticum aestivum）、西洋梨（Pyrus communis）、苜蓿（Medicago truncatula）、巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）的H+-PPase同源性都是86%以上，特别与大麦的H+-PPase同源性更是高达98%。与原生动物（Protozoa）、海藻类（Marine alga）的同源性只有40%（未列出），这说明H+-PPase在高等植物中具有很高的同源性（图2）。

2.2 EdHP1基因的Northern blot分析

取不同胁迫条件下处理的披碱草材料，提取总RNA，进行Northern blot分析，用EdHP1基因为探针进行杂交。结果（图3）表明，EdHP1在高盐和干旱条件下有明显诱导，从1 h开始逐渐增强，在24 h达到最大。在低温胁迫条件下，EdHP1表达先增强后减弱，5 h表达量最高，12 h表达量下降。在ABA处理条件下没有响应。

2.3 EdHP1转基因烟草的抗逆性功能分析

2.3.1 EdHP1转基因烟草的抗旱性分析 在MS+2%PEG的培养基上培养4周后，未转基因烟草（Wt）地上和地下部分生长都受到了严重的抑制，而转基因株系（EdHP1）形成了一定数目的根，且茎和叶的发育也明显优于Wt（图4B）。处理之前Wt和转基因株系地上部分的平均长度分别为1.2 cm和1.1 cm（图4C），处理之后转基因株系地上部分的平均长度（4.5 cm）明显比Wt（1.5 cm）长（P<0.01）（图4D），处理之后转基因株系地下部分的平均长度（5.5 cm）也明显比Wt（0.1 cm）长（P<0.01）（图4E）。为了进一步确定EdHP1基因的表达与转基因烟草抗旱性的关系，对转基因植株中该基因的表达进行了RT-PCR分析，结果表明，转基因植株中EdHP1基因表达而在未转基因烟草中没有EdHP1基因的表达（图4G）；对烟草中的H+-PPase活性进行测定发现转基因烟草（EdHP1）是未转基因烟草（Wt）的2倍以上（图4F），这说明由于EdHP1基因的表达提高了转基因烟草的抗旱性。

2.3.2 EdHP1转基因烟草的耐低温能力分析 生长两周左右的未转基因烟草（Wt）和转基因株系（EdHP1）在-4 ℃处理12 h后，转入正常生长条件下恢复培养过程中，Wt的茎叶逐渐失绿，最终枯死（图5B），而转基因株系植株没有受到明显的影响，生长恢复（图5B）。RT-PCR结果表明，在转基因植株中EdHP1基因表达，而在Wt中则没有EdHP1基因的表达（图5C）。这说明由于EdHP1基因的表达提高了转基因烟草的耐低温能力。

3 讨论

H+-PPase具有质子泵的功能，可以分解PPi为离子的运输和一些次级代谢提供能量，在这方面和ATP具有类似的功能，在逆境下H+-PPase还可以提高ATP的活性。目前，H+-PPase基因对低温胁迫的响应方式也有不同看法，Yoshida等[15]报道绿豆苗H+-PPase在低于10 ℃的温度下，H+-PPase质子转运速率降低。但在检测2 ℃处理的绿豆悬浮细胞H+-PPase活性后认为，冷处理期间H+-PPase较为稳定，48 h以内没有表现出明显受抑制现象，甚至在处理的最初12 h内还稍有促进。Carystinos等[16]则发现冷诱导H+-PPase活性大幅度上升，10 ℃冷处理6 d的水稻苗H+-PPase比活是常温（25 ℃）下的20倍，同时免疫反应蛋白也显著增加，说明H+-PPase是冷诱导。在本试验中EdHP1对4 ℃处理的响应是先升高后降低，表明EdHP1基因参与了植物对低温的响应。Brini等[17]将H+-PPase转入拟南芥发现转基因植物的耐旱性得到明显的提高，Park等[18]将AVP1基因转入番茄（Lycopersicon esculentum）的一个商业栽培品种中，轉基因植株抗旱性明显增强。Gao等[19]将盐芥中的H+-PPase转入拟南芥发现转基因植物的耐盐性得到明显的提高。可见，H+-PPase作为一种有效的质子泵，在植物对水分和盐分胁迫的响应中可能扮演着重要的角色。EdHP1能够显著提高转基因烟草抗旱性和耐低温能力，推测可能的作用机制是EdHP1影响了生长素的运输，促进了根系和地上部分的生长，从而提高了植物的抗逆性，由此可见EdHP1可以作为优良的基因资源用于改良作物的抗逆性。

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