吉力尔鬼，乃古沙黑，杜家明，余仲东

(1.布拖县林业局，四川 布拖616350；2.通江县林业局，四川 通江 621055；3.西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100)

小叶杨叶片内生菌Botryospaeriadothidea对杨树枝干致病性研究

吉力尔鬼1，乃古沙黑1，杜家明2，余仲东3,*

(1.布拖县林业局，四川 布拖616350；2.通江县林业局，四川 通江 621055；3.西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100)

Botryospaeria属真菌引起的溃疡病是危害树木较严重的病害之一，在世界各地造成了严重的生态和经济后果。本文在分离陕西省内两个不同地域小叶杨叶片内生菌的过程中，得到大量的Botryospaeria菌株，通过培养特征和形态学分析发现，叶片内生菌Botryospaeria菌株和树干分离的杨树溃疡病菌B.dothidea无明显差别。内生菌B.dothidea是宝鸡地区的优势菌株，且只出现在早春时节。采用人工打孔接种法，将叶片内生Botryospaeria回接到三倍体毛白杨2年生枝条上发现，叶片内生葡萄座腔菌对枝条具有明显的致病性，但相比枝干上分离的溃疡病菌B.dothidea菌株，其致病性要弱。

小叶杨;溃疡病；Botryospaeria；内生菌

Botryospaeria属真菌是全球分布的病原真菌，寄主范围十分广泛，可为害多种针叶树和阔叶树。针叶树中的杉木属、落叶松属、松属、雪松属、北美红杉属、刺柏属、柏木属和铁杉属等11个属可被侵染，而该属真菌侵染的阔叶树达40 属之多，其中杨树被害患病的情况居多[1]。通常，Botryospaeria属真菌为害林木枝干及果实，引起枝枯、溃疡、流胶和果腐等，如杨树水泡型溃疡病,苹果干腐病、轮纹病,桃梅等核果类果树流胶病等[2]，然而在小叶杨健康叶片的分离中，我们分离到大量的枝干病原物，如Botryospaeria、Cytospora、Phompsis、Thielavia等属传统树木溃疡病菌。为探明它们的生态学功能及与枝干溃疡病菌在形态和致病性上的异同点，我们以Botryospaeriaspp.为材料，比较分析了叶片内生Botryospaeria真菌(简称EB)和枝干溃疡病菌(简称CB)在形态学和分子系统学上的差异，及它们对三倍体毛白杨2 a生枝条的致病性的差异。

1 材料和方法

1.1 样品采集与分离

2013年春季和秋季分别在凤县南凤，太白县的鹦鸽桃川、石灰厂，榆林榆阳区的无定河、青云、红山等地设点，每点4～5棵树，分别从树冠的东南西北4个方向采集小叶杨(Populussimonii)健康叶片，标记采集地点，时间等，装入塑封袋，冰盒保存，带回实验室分离。首先将表面消毒后的叶片接种到PDA培养基上，编号后在25 ℃恒温培养箱中恒温培养，并定期观察菌落生长情况、生长特征等，对细菌污染的叶片进行重新接种。每个方向接种2个叶片，8个重复。消毒方法为：1%次氯酸钠消毒2 min后，无菌水漂洗2次，每次1 min。以某种或某一类内生真菌的菌株数量占分离到总菌株数量的百分比(相对分离率 RF)，来反映不同种类的内生真菌在总菌群中所占据的优势程度。

1.2Botyosphaeria筛选及鉴别

根据培养形态特征，挑选纯化可能的Botryosphaeria菌落。待菌落形成子实体后，依据形态学特征确定Botryosphaeria菌株并保存备用。

1.3Botryosphaeria致病性测定

取2 a生大小均匀的三倍体毛白杨枝条，截成长12 cm 枝条，顶端用蜡封后置烧杯中水培5～7 d，以确定枝条生命力是否旺盛。将培养好的Botryosphaeria菌株PDA菌落用直径0.5 cm的大孔器打菌饼进行人工接种，用封口膜密封。每个枝条3个接种孔，2个接菌饼，另一个(在相对一面)接无菌的PDA。以分离自青杨上的杨树溃疡病菌Botryosphaeriadothidea(来自大连，编号NW2011-003)为对照，接种方法同前。在25 ℃ 的温室中光照培养15 d，用游标卡尺测量病斑大小，取均值进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 内生菌的分离情况

在地理气候迥异的6个采集点中，从叶片中共分离内生真菌1 160株，隶属3目、11科、35属。其中在太白鹦鸽的优势菌群为交链孢属(Alternariasp.，RF=18.55%)、单隔孢属(Ulocladiumsp.，RF=31.44%)、茎点霉属(Phomasp. ，RF=17.01%)；桃川的优势菌群有交链孢属(Alternariasp.， RF=21.05%)、单隔孢属(Ulocladiumsp.，RF=17.54%)、茎点霉属(Phomasp. ，RF=11.11%)、毛壳菌属(Chaetomiumsp. ，RF=11.70%)、梭孢壳属(Thielaviasp. ，RF=10.53%)；凤县南凤优势菌群有交链孢属(Alternariasp. ，RF=13.83%)、单隔孢属(Ulocladiumsp. ，RF=14.36%)、枝孢霉属(Cladosporium.sp. ，RF=14.11%)、拟茎点霉属(Phomopsissp. ，RF=14.36%)；榆林红山优势菌群为交链孢属(Alternariasp.， RF=24.06%)、单隔孢属(Ulocladiumsp. ，RF=10.38%)、茎点霉属(Phomasp. ，RF=32.08%)、壳蕉孢属(Cytosporasp. ，RF=10.38%)；青云优势菌群为交链孢属(Alternariasp. ，RF=30.97%)、单隔孢属(Ulocladiumsp.，RF=12.26%)、壳蕉孢属(Cytosporasp.， RF=14.84%)；无定河的优势菌群为交链孢属(Alternariasp.， RF=37.92%)、单隔孢属(Ulocladiumsp. ，RF=34.17%)。

Botryosphaeria属真菌仅在4月份宝鸡的凤县南凤和太白县桃川、石灰厂杨树上分离到。在全部分离样点中，Botryosphaeria菌株相对分离率RF=1.03%；但在宝鸡的3个分离点中RF=4.62% ，属于优势菌群。陕北榆林的青云、红山、无定河没有分离到。Botryosphaeria属菌株标记为SHC-1-E2-2(2)、SHC-4-W1-2(2)、TC-2-E2-1(1)、FN-1-E2-1(1)、FN-2-N2-1(1)、TC-4-W2-4(1)、FN-4-N1-1(1 )、FN-4-E1-1(2)、FN-4-W1-1(1)，所有菌株均保存在西北农林科技大学森林病理室。从培养特征和分生孢子形态特征和产孢结构看，所有的Botryosphaeria菌株可能为同于一个种，即葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea。

在空间上，Botryosphaeriadothidea的发生与地理环境密切相关，宝鸡地区相对榆林地区来讲，降雨量和空气湿度有明显的差异，可能是影响B.dothidea分布的主要原因。在时间上，内生Botryosphaeria属菌株只出现在4月至5月中旬，说明小叶杨叶片中葡萄座腔菌菌落很可能来自该菌越冬后子囊孢子的侵染。其定殖机理需进一步研究。

2.2Botryosphaeria菌株致病性测定结果

小叶杨叶片内生Botryosphaeriadothidea接种三倍体毛白杨都能导致枝条形成明显的溃疡扩展斑，而且各菌株致病性几乎相似。与枝干溃疡病菌B.dothudea接种结果比较，内生葡萄座腔菌的致病性相对较弱，病斑扩增速度慢，但病斑大小均匀，相对标准差仅0.05; 而溃疡病菌B.dothidea病斑扩增迅速，病斑大，但病斑差异较大，相对标准差5.04。

图2 Botryosphaeria的人工接种(左：CB；右：CE)

3 结论与讨论

小叶杨叶片内生葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea的发生与湿润的环境气候条件有关。本研究中， 仅在4—5月份的宝鸡地区3个采集点叶片中分离到，而在其他时间和地点没能分离到叶片内生葡萄座腔菌。B.dothidea很可能以子囊孢子侵染叶片，叶片周围湿润的微环境气候条件为子囊孢子的成功定值创造了条件。在7—9月材料的分离中，Botryosphaeria主要以无性形态存在于树体或环境中，宝鸡地区的3个采集点和陕北的3个采集点都未能分离到，说明Botryosphaeria分生孢子可能很难定植于叶片。叶片内生葡萄座腔菌接种抗性较强的三倍体毛白杨实验表明，该菌仍然具有较强的致病性，但相对于枝干溃疡病菌Botryosphaeriadothidea来说，其致病性较弱，其中的原因尚不清楚。

在小叶杨叶片内部分离到的内生真菌中有许多是多种树木病原菌例如Cytosporasp.，Botrysphaeriasp.，Valsasp.、Collectotrichumsp.、Phomasp.等，它们可引起许多杨树溃疡病、腐烂病、炭疽病等病害。Botrysphaeriaspp.被报道是许多树木的内生真菌，在全球气候变化或树木树势衰退的情况下可以转变成病原菌，引起树木溃疡症状[3]。病原真菌和内生真菌的关系至今还不是很清楚，植物组织中许多内生真菌，在寄主植物的衰老阶段，也会以病原菌的方式出现；有许多学者认为，当宿主植物的防御能力与病原菌的致病力达到一个平衡的时候，植物病原菌就不会表现致病能力，反而是以一种内生菌的方式存在的[4]。也有人认为环境条件和气候特征等因素的改变是这种关系改变主要诱导因素，在植物处在环境胁迫的状态下，内生真菌就会引起植物变现病害，当植物处在适宜的环境条件下，这种潜在的病原菌可能就会延迟病害症状的出现，以一种内生真菌的状态存在于植物组织中[5-6]。在全球气候变化下，研究内生菌这种平衡转化关系对揭示森林的衰退和次生病虫害的爆发有着重要的理论意义，本文研究结果对树干溃疡病类的侵染和传播为害方式提供了一个新的视野。

[1] 吴小芹，何月秋，刘忠华.葡萄座腔菌属所致树木溃疡病发生与研究进展[J].南京林业大学学报,2001,25(1):423-430.

[2] 张星耀,赵仕光,吕全等.树木溃疡病病原真菌类群分子遗传多样性研究II-Bot ryosphaeria 属28S-DNA-PCR-RFLP 和RAPD 的解析[J].林业科学,2000,36 (2) :75-81.

[3] Carroll G C．1986．The biology of endophytism in plants with particullosphere[M]．London： Cambridge Press，205-222.

[4] Schulz B and Boyle C． The endophyte continuum[J]．MycolRes，2005,109(6)：661-686.

[5] Arnold A E，Herre E A． Canopy cover and leaf age affect colonization by tropical fungal endophytes：Ecological pattern and process inTheobromacacao[J]．Mycologia，2003,95：388-398.

[6] Benedicte R A，Lars B，Akkamahadevi V，Asa H，Mats W，Jan k，Stefan J． Endophytic fungi in European aspen(Populustremula)leaves-diversity，detection，and a suggest correlation with herbivory resistance [J]．FungalDiversity，2010,41：17-28.

EndophyticBotryosphaeriadothideafrom Leaves ofPopulussimoniiPathogenesis to Branch of Poplar

JILI Er-gu1, NAIGU Sha-hei1, DU Jia-ming2, YU Zhong-dong3,*

(1.ButuoForestryBureau,Butuo,Sichuan616350; 2.TongjiangForestryBureau,Tongjiang,Sichuan621055;3.NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100)

Botryosphaeriacanker is one of the most danger disease, causing serious ecologic and economic lost worldwide. In this study, we collected endophyticBotryosphaeriastrains isolated fromPopulussimoniiat Baoji and Yulin, two distinctive geo-ecological locus in Shaanxi Province. Results showed endophyticBotryosphaeriastrains had no significant difference from canker pathogenB.dothideamorphologically. The endophyticBotryosphaeriaspecieres appeared only in the humid area at early spring in Baoji region, and it was one of advantageous endophyte communities ofPopulussimoniiin this region. The pathogenesis of endophyticBotryosphaeriadothideawas so forward checked by inoculation in triploidPopulustomentosae2-year-old cuttings artificially, and showed a positive pathogenesis result. However, this pathogenesis of endophyticB.dothideais weaker than that of canker pathogenicB.dothidea.

Populussimonii; canker;Botryospaeria; endophyte

2016-11-10

国家自然科学基金(NO.31670650)。

吉力尔鬼(1978-)，男，四川布拖县人，林业工程师,主要从事林业资源管理工作。

S763.15

A

1001-2117(2017)02-0012-03

*通讯作者