王彦超，邓蓉蓉，叶亚东，席志鹏，康然，谢林

(1南京中医药大学，南京210023；2南京中医药大学附属中西医结合医院；3泰州市中医院)

补肾活血舒筋方含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、迁移的影响及其机制

王彦超1,2，邓蓉蓉2，叶亚东3，席志鹏2，康然2，谢林2

(1南京中医药大学，南京210023；2南京中医药大学附属中西医结合医院；3泰州市中医院)

目的 探讨补肾活血舒筋方含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖、迁移的影响及其可能的作用机制。方法 采用全骨髓贴壁法分离提取大鼠BMSCs并进行验证。制备补肾活血舒筋方低、中、高浓度含药血清(1.1、2.2、4.4 g/mL)及空白血清，将大鼠BMSCs随机分为含药血清低、中、高浓度组和空白对照组，分别加入上述血清。采用CCK-8法检测各组增殖能力(以细胞生存率表示)，Transwell小室试验检测细胞迁移能力(以细胞迁移数量表示)，Western blotting法检测趋化因子受体4(CXCR4)和NF-κB信号通路p65蛋白表达。结果 各组间细胞生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)。含药血清高、中浓度组细胞迁移数量均高于含药血清低浓度组、空白对照组，且含药血清高浓度组高于含药血清中浓度组(P均<0.05)。含药血清高、中、低浓度组与空白对照组p65、CXCR4蛋白表达依次降低，组间两两比较P均<0.05。结论 2.2、4.4 g/mL补肾活血舒筋方含药血清可促进BMSCs迁移，但对BMSCs增殖无影响；激活NF-κB信号通路可能是其作用机制。

骨髓间充质干细胞；补肾活血舒筋方；细胞迁移；核转录因子κB；趋化因子受体4；大鼠

间充质干细胞(MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、自我复制、靶向归巢和损伤修复等特点。研究证实，基质细胞衍生因子1(SDF-1)等趋化因子具有调控MSC归巢的作用，其与趋化因子受体4(CXCR4)结合形成的SDF-1/CXCR4轴是促进MSC向损伤组织归巢的重要生物轴[1]，同时该轴调控细胞归巢的作用受NF-κB信号通路的调节[2]。补肾活血舒筋方对于脊柱退行性变有一定疗效[3,4]，且能够调节CXCR4表达[5]，促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)迁移[6]。前期研究显示，补肾活血舒筋方可通过调节NF-κB信号通路抑制炎症反应及椎间盘退变[7]。本研究观察了补肾活血舒筋方含药血清对大鼠BMSCs增殖、迁移的影响，现分析结果并探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物： 4周龄SD大鼠24只，SPF级，均为雌性，平均体质量80 g，由南京中医药大学附属中西医结合医院动物中心提供。主要试剂：MEM培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司，兔抗大鼠NF-κB(p65)、CXCR4抗体/羊抗兔远红外二抗购于美国Abcam公司。主要仪器：流式细胞仪购于美国Millipore公司，多功能酶标仪购于瑞士Tecan公司，ODYSSEY双色红外荧光扫描成像系统购于美国LICOR公司。

1.2 大鼠BMSCs提取与鉴定 取4周龄SD大鼠4只，分离双侧股骨和胫骨，采用全骨髓贴壁法[8]提取BMSCs：将细胞放置于完全培养基(含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的MEM培养基)中，于5% CO2、37 ℃培养箱中进行培养，每3天换液1次。待细胞在T25培养瓶中生长融合至80%～90%时，以1∶3进行传代，传至第3代时倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。结果显示，第3～5代细胞纯化程度高，细胞增殖能力强；传代后的细胞呈纺锤形或梭形，细胞数目多、排列紧密时可呈漩涡状。取第3代细胞，采用流式细胞仪检测其表面抗体CD29、CD34、CD45、CD90表达，结果显示其阳性率分别为91.77%、85.40%、0.22%、2.20%，证实该细胞为BMSCs。

1.3 补肾活血舒筋方含药血清制备 补肾活血舒筋方中药组成参照谢林等[3]的研究，取其方药以纯净水煎煮，将药液过滤、浓缩，调配至1.1、2.2、4.4 g/mL(以生药量计算)，分别记为低、中、高浓度。将20只SD大鼠随机分为四组，每组5只，分别以1.1、2.2、4.4 g/mL药液及纯净水灌胃，剂量为2 mL。连续灌胃14天后采血，血样静置2 h后3 000 r/min离心20 min，取上清。

1.4 含药血清对大鼠BMSCs增殖、迁移能力影响的观察

1.4.1 细胞培养及干预 取生长状态良好的第3代BMSCs，用含10%胎牛血清的MEM培养基制成细胞悬液，以5×103个/孔接种于96孔板。将细胞分为含药血清低、中、高浓度组及空白对照组，每组设3个复孔。培养24 h后更换为MEM培养基继续培养24 h。含药血清低、中、高浓度组每孔分别加入低、中、高浓度含药血清10 μL，空白对照组加入等量空白血清。

1.4.2 细胞增殖能力 采用CCK-8法。取各组干预后细胞，5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL后继续孵育4 h。采用酶标仪在460 nm波长处测定光密度(OD)值，用不含细胞的完全培养基做空白对照，计算细胞生存率。细胞生存率=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100%。实验重复3次。

1.4.3 细胞迁移能力 采用Transwell小室试验。取处理48 h的各组细胞，消化后进行计数，调整细胞密度为1×106个/mL，悬于含2%胎牛血清的MEM培养基中。将Transwell装置置于培养箱中平衡30 min，上室接种1×105个细胞(体积为100 μL)，下室为含100 ng/mL SDF-1α、2%胎牛血清的MEM培养基(体积为500 μL)，置于CO2培养箱中12 h。弃去培养液，PBS清洗后4%中性甲醛固定15 min；结晶紫染色15 min，弃染色液， PBS清洗2次。用棉签小心擦掉上室上侧细胞，再用小刀取下小室的聚碳酯膜，于倒置相差显微镜下对Transwell上室下侧细胞进行计数，即细胞迁移数量。

1.5 NF-κB信号通路p65蛋白、CXCR4蛋白表达检测 采用Western blotting法。取生长良好的第3代BMSCs，消化处理后以1×105个/孔接种于6孔板，予MEM培养基饥饿处理8 h，使其生长同步化。参照1.4.1的方法进行分组处理48 h后收集细胞。加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，收集并提取细胞总蛋白。采用BCA法测定各组蛋白质浓度，使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液调整至统一的蛋白质浓度，以每道10 μL蛋白上样。80 V电压电泳10 min，观察到溴酚兰进入分离胶后，电压改为120 V，继续电泳80 min。使用甲醇化的硝酸纤维素(PVDF)膜在350 mA电流下转膜120 min，5%脱脂牛奶封闭。分别加入兔抗大鼠p65、CXCR4蛋白抗体，置于水平摇床4 ℃孵育过夜。用TBST对PVDF膜漂洗3次，每次10 min，加入二抗IgG(羊抗兔红外二抗)，室温避光孵育1 h；再用TBST对PVDF膜漂洗3次，每次10 min。使用ODYSSEY双色红外荧光扫描成像系统对目的条带进行扫描，并采用Image-Pro Plus6.0软件分析灰度值，以GAPDH作为内参。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

2 结果

2.1 各组细胞生存率比较 含药血清高、中、低浓度组与空白对照组细胞生存率分别为(99.80±1.23)%、(102.92±1.49)%、(102.65±1.43)%、(101.71±0.91)%，多组间比较P>0.05。

2.2 各组细胞迁移数量比较 含药血清高、中、低浓度组与空白对照组细胞迁移数量分别为(95.00±1.78)、(69.75±1.89)、(17.25±0.95)、(16.50±0.65)个，含药血清高、中浓度组均高于含药血清低浓度组、空白对照组，且含药血清高浓度组高于含药血清中浓度组(P均<0.05)；空白对照组与含药血清低浓度组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组p65、CXCR4蛋白表达比较 各组p65、CXCR4蛋白相对表达量比较P<0.05，组间两两比较P均<0.05。见表1。

表1 各组p65、CXCR4蛋白相对表达量

3 讨论

2009年Krap等[9]建议将MSC归巢定义为：MSC在目标组织的脉管系统里被捕获，随后跨越血管内皮细胞迁移至目标组织的过程。对于归巢机制，尤其是干细胞的动员，目前仍无法准确阐述，大部分研究文献基于白细胞迁移、人类干细胞以及转移肿瘤细胞研究干细胞的迁移行为，针对各种细胞表面受体及细胞因子进行探索。SDF-1又称CXCL12，是趋化因子家族中的CXC亚族。CXCR4是目前研究最多的SDF-1受体，可同时在多种细胞表面表达，包括血液细胞、造血干细胞(HSCs)、胚胎干细胞(ES)[10]。研究表明，趋化因子家族及其受体不但能介导白细胞迁移，同时在MSC归巢中也发挥着重要作用，其中SDF-1/CXCR4轴的主要功能之一就是调节前体细胞的趋化及归巢至受伤部位[11]。

当组织受到损伤时，局部SDF-1表达上调，营造出一个SDF-1高浓度环境，随着距离的增加，SDF-1浓度梯度递减，而趋化表达CXCR4的MSC沿着这个浓度梯度到达组织损伤部位，参与组织的修复与重建。亦有学者认为，SDF-1α/CXCR4趋化信号轴是进化上高度保守的介导干细胞迁移、分布的关键信号[12]，在MSCs募集和定向迁移中发挥关键性作用。Pereira等[13]将SDF-1注射入髓核中，发现MSCs能够穿越软骨终板，向髓核迁移。CXCR4是决定MSCs归巢能力的主要效应分子，其表达水平将直接影响MSCs的迁移能力。Wei等[14]研究发现，过表达CXCR4的BMSCs向SDF-1的迁移能力增强，其在椎间盘组织存活时间更久，对椎间盘组织的再生和修复能力更强。SDF-1/CXCR4信号轴可激活多重信号通道，包括MAPK p42/44、Jak/STAT和PI3K-AKT-NF-κB信号通道[15]。NF-κB是细胞内最重要的核转录因子，在许多细胞刺激介导细胞信息的转录调控中起核心作用，参与调节炎症反应，是细胞激活的标志，参与正常细胞和肿瘤细胞的生长和增殖[16]。NF-κB可通过调节SDF-1/CXCR4信号轴参与细胞的迁移、侵袭等过程，CXCR4表达是NF-κB和CXCR4基因启动子通过调节p50/p65结合位点来实现的[15]。

研究发现，部分中药对干细胞归巢具有一定的调节作用[17,18]，尤其是补肾活血类中药，不但能够调节CXCR4表达[5]，还能促进BMSCs的迁移[6]。前期研究显示，补肾活血舒筋方可以通过调节NF-κB信号通路，抑制椎间盘的退变[7]。本研究各组间细胞生存率比较差异无统计学意义，而含药血清高、中浓度组细胞迁移数量均高于含药血清低浓度组、空白对照组，说明补肾活血舒筋方对BMSCs增殖无明显影响，但中、高浓度时可促进其迁移。考虑补肾活血舒筋方影响细胞迁移时存在一定的药物浓度阈值，需要达到一定的药物浓度，细胞才可能被动员，发生迁移。本研究结果显示，补肾活血舒筋方含药血清可促进p65、CXCR4蛋白表达，并呈浓度依赖性；说明补肾活血舒筋方可能通过NF-κB信号通路调节CXCR4蛋白表达，进而促进BMSCs迁移。

综上所述，2.2、4.4 g/mL补肾活血舒筋方含药血清可促进BMSCs迁移，但对BMSCs增殖无影响；激活NF-κB信号通路可能是其作用机制。

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江苏省自然科学基金资助项目(BK20151064)。

谢林(E-mail： xielin117@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.011

R329

A

1002-266X(2017)16-0038-03

2016-10-15)