谭小兵戴青原

1.云南省第一人民医院口腔内科；2.昆明医科大学第一附属医院心内科，昆明 650032

人牙源性多能干细胞重编程前后微小RNAs差异表达谱系分析

谭小兵1戴青原2

1.云南省第一人民医院口腔内科；2.昆明医科大学第一附属医院心内科，昆明 650032

目的 对比研究两种人牙源性多能干细胞重编程前后微小RNAs（m iRNAs）差异表达，交集分析、筛选特异性m iRNAs。方法 利用仙台病毒将人牙髓干细胞（DPSCs）和根尖乳头干细胞（SCAP）重编程为诱导性多潜能干细胞（iPSCs），提取总RNA，m iRNAs标记、杂交，扫描芯片、读取图像，筛选差异表达m iRNAs，交集分析。

结果 人DPSCs和SCAP均可重编程为iPSCs。m iRNAs芯片分析结果显示人DPSCs重编程后有68个差异表达m iRNAs（倍数>10），其中37个表达上调，31个表达下调；人SCAP重编程后有107个差异表达m iRNAs（倍数>10），其中

68个表达上调，39个表达下调。二者取交集，均上调的有miR-302e，下调的有m iR-29b-3p、m iR-181b-5p、m iR-4328、

m iR-22-5p、m iR-145-5p、m iR-4324、let-7b-5p、m iR-181a-5p、m iR-27b-3p（倍数>10）。结论 人DPSCs和SCAP重编程为iPSCs过程中有多种m iRNAs参与，多数与细胞周期、上皮-间充质转化、转化生长因子β信号通路等相关。

诱导性多潜能干细胞； 牙髓干细胞； 根尖乳头干细胞； 重编程； 微小RNAs

近十年来干细胞研究领域的突破性进展之一就是诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的建立[1-2]。体细胞可通过多种方法重编程为iPSCs，主要分为病毒性载体和非病毒性载体，如RNA、微小RNAs（m icroRNAs，m iRNAs）转染等[3]。学者[4]对iPSCs的复杂调节网络、m RNA和m iRNAs进行了全基因组研究，其中引起更多关注的就是m iRNAs。m iRNAs通过降解靶mRNA或阻止蛋白合成以调节多种目标基因的表达。m iRNAs在各种细胞中均有表达，包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）、iPSCs和体细胞。通过对不同人ESCs、iPSCs的m iRNAs及mRNA表达的研究，发现了许多共同表达的m iRNAs簇，如m iR-290、 m iR-302-367等[5]。

本课题组前期研究将人牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）和根尖乳头干细胞（stem cells form apical papilla，SCAP）重编程为iPSCs[6]，但重编程后DPSCs和SCAP的m iRNAs差异表达情况尚不清楚。为了更好地了解人牙源性干细胞重编程过程miRNAs的表达情况，本研究采用m iRNA芯片分析技术，比较人DPSCs和SCAP重编程后m iRNA差异表达情况，通过交集分析筛选几种特异性表达m iRNAs，为进一步研究m iRNA在重编程中的作用机制提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

α-最低必需培养基（minimum essential medium，MEM）、Ⅰ型胶原酶、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）结合CD24/CD34/CD45/Stro-1、TRIzol试剂盒（Invitrogen公司，美国），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Hyclone公司，美国），Ⅱ型中性蛋白酶（Roche公司，瑞士），2.5 g·L-1胰蛋白酶/0.25 mmol·L-1EDTA（Gibco公司，美国），PE结合CD90/CD105/CD146/Oct-4（eBioscience公司，美国），RNeasy M ini Kit RNA提取试剂盒（QIAGEN公司，德国），m iRNAs标记试剂盒m iRCURY™ Hy3™/Hy5™ Power labeling kit、miRNAs芯片杂交试剂盒miRCURYTMLNA Array（Exiqon公司，丹麦），NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Fisher公司，美国），流氏细胞仪（Beckman公司，美国）、Axon GenePix 4000B芯片扫描仪（Axon公司，美国）。

1.2 人DPSCs 和SCAP体外分离培养及鉴定

收集云南省第一人民医院口腔颌面外科因阻生拔除的下颌第三磨牙（患者年龄小于20岁），按照Gronthos等[7]的方法进行原代培养：收集牙髓和根尖乳头组织，充分剪碎，3 mg·mL-1Ⅰ型胶原酶+4 mg·mL-1Ⅱ型中性蛋白酶消化液、37 ℃震荡孵育60 m in，离心、弃上清，加入α-MEM完全培养基（α-MEM+ 15%FBS+1%谷氨酰胺+1%青/链霉素），过70 μm细胞滤器得到单细胞悬液，加入适量完全培养基，常规培养，第2~5代细胞用于实验。本实验所有操作均符合云南省第一人民医院伦理委员会标准，取得患者书面同意。收集第3代DPSCs、SCAP，流式缓冲液吹打后加入10 μL相应抗体（CD24、CD34、CD45、CD90、CD105、CD146、Stro-1），室温避光孵育30 m in；加入1%多聚甲醛，上机检测。Oct-4、大鼠IgG2aK-PE同型对照流式抗体处理：4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）固定液、室温避光孵育20 m in，1 500 r·m in-1离心5 min，弃上清，加入1×细胞打孔液，室温避光孵育10 m in，同样条件离心、弃上清，加入对应抗体10 μL，再加入杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s phosphate buffer saline，D-PBS）混匀，室温避光孵育30 m in，加入1%多聚甲醛液，流氏细胞仪检测，Summ it 5.1软件分析数据。

1.3 人DPSCs、SCAP的重编程

按照CytoTune-iPS仙台病毒重编程试剂盒说明书进行如下操作：转染前2 d，将第3代人DPSCs、SCAP铺到6孔板内（每孔1×105个），常规培养。转染当天（第0天），将适量仙台病毒（Sendai virus，SeV）溶解到70 μL牙干细胞培养基内开始转染，1 d后（第1天）再加入130 μL牙干细胞培养基，第2天换新鲜含SeV培养液继续转染。第3天将已转染细胞转移到基质胶覆盖6孔板内，重编程培养基继续培养，3周左右可以观察到克隆出现。克隆成熟时，“十字法”分割克隆，转移到新培养板内（基质胶覆盖），记为iPSCs第一代（P1），PSC-easy培养基（含10 μmol·L-1Y27632，选择性ROCK1抑制剂）继续培养，克隆90%融合时，Ⅳ型胶原酶消化传代，4~ 5 d传代一次。随机挑选部分克隆进行长期培养观察。常规培养人ESCs（H9，第55代）作为标准对照。

1.4 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription poly- merase chain reaction，RT-PCR）鉴定人DPSCs- iPSCs和SCAP-iPSCs

收集DPSCs-iPSCs和SCAP-iPSCs（第12代），提取总RNA，5 μL RNA、逆转录试剂盒合成cDNA，反应条件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。聚合酶链反应：95 ℃ 5 m in，35次循环（95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），72 ℃ 7 min，电泳检测、成像。检测iPSCs特异性标记物Oct-4、Sox2、K lf4、c-M yc的表达，GAPDH为管家基因，水为阴性对照（引物序列见表1）。

表 1 iPSCs特异性标记物基因引物序列Tab 1 Base sequences of specific markers for iPSCs

1.5 人DPSCs、SCAP重编程前后m iRNAs差异表达分析

1.5.1 总RNA提取 常规培养人DPSCs、SCAP（第3代）和DPSCs-iPSCs、SCAP-iPSCs（第12代），90%融合时收集细胞，TRIzol试剂盒提取总RNA，RNeasy M ini Kit RNA提取试剂盒纯化样品，NanoDrop ND-1000分光光度计检测RNA浓度。

1.5.2 RNA标记与芯片杂交 1）miRCURY™ Hy3™/ Hy5™ Power labeling kit试剂盒对样品miRNAs进行标记：1 μL总RNA加水至2 μL，加入1 μL小牛肠磷酸酶缓冲液（calf intestine phosphartase，CIP）和CIP酶，混合后置于37 ℃下30 m in，95 ℃ 5 m in终止反应，再加3 μL标记缓冲液、1.5 μL免疫标记剂（Hy3™）、2.0 μL二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、2.0 μL标记酶，16 ℃反应1 h，65 ℃ 15 m in终止反应；2）芯片杂交：将Hy3™标记样品与m iRCURY™LNA Array杂交芯片杂交，Hy3™标记的全部25 μL混合物与25 μL杂交缓冲液混合，95 ℃变性2 m in，然后置于冰上2 m in，56 ℃杂交16~20 h（Nimblegen系统平台，Roche公司，美国），清洗缓冲液试剂盒Wash buffer kit清洗芯片3次；3）Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片。

1.5.3 数据分析方法 使用GenePix Pro 6.0扫描分析软件读取芯片扫描图像，并提取探针的信号值。相同的探针取中值合并。保留在所有样品中均大于30.0的探针，对全部芯片进行中值标准化，筛选差异表达探针，绘制散点图。

使用倍数变化和P值筛选两组样品间（有重复）的差异表达m iRNAs，使用倍数变化筛选两个样品间（没有重复）的差异表达m iRNAs，最后进行交集分析。

2 结果

2.1 人DPSCs和SCAP原代培养及鉴定

2种细胞体外分离培养4 d形成克隆，10 d左右铺满培养瓶（图1）。流式细胞仪检测结果显示，DPSCs、SCAP均不表达CD34、CD45，几乎100% DPSCs、SCAP均为CD90、CD105阳性，CD146染色均为强阳性（分别为28.4%、54.8%），Stro-1（分别为28.3%、12.4%）、Oct-4（分别为43.6%、58.0%）染色均为阳性，仅SCAP表达CD24（10.9%）（图2）。

图 1 人DPSCs和SCAP原代培养 倒置相差显微镜 × 100 Fig 1 Primitive culture of human DPSCs and SCAP inverted phase contrast microscope × 100

图 2 人DPSCs、SCAP特异性标记物的表达Fig 2 The expression of specific markers of human DPSCs and SCAP

2.2 人DPSCs-iPSCs、SCAP-iPSCs细胞重编程及鉴定

转染细胞接种到基质胶，重编程培养3~4周后逐渐出现ES样克隆，边缘锐利清晰，此时ESCs样克隆即为iPSCs原代细胞（P0，图3）。

图 3 人DPSCs-iPSCs、SCAP-iPSCs体外培养 倒置相差显微镜Fig 3 Culture of human DPSCs-iPSCs and SCAP-iPSCs in vitro inverted phase contrast m icroscope

RT-PCR结果显示，重编程得到的iPSCs特异性表达干细胞标记物Oct-4、Sox2、K lf4、c-M yc与人ESCs细胞系H9相同，证明得到的为已完全重编程的iPSCs（图4）。

图 4 人牙源性iPSCs特异性标记物RT-PCR分析结果Fig 4 RT-PCR analyses for human iPSCs specific marker genes Oct-4, Sox2, K lf4 and c-M yc

2.3 人DPSCs和SCAP重编程前后m iRNAs差异表达分析

共分析了2 085个miRNAs，其中人DPSCs重编程后有68个差异表达m iRNAs（倍数>10），其中37个表达上调，31个表达下调；人SCAP重编程后有107个差异表达miRNAs（倍数>10），其中68个表达上调，39个表达下调；二者差异表达miRNAs取交集，结果发现人DPSCs和SCAP重编程后m iRNAs均上调的有m iR-302e，均下调的有m iR-29b-3p、m iR-181b-5p、miR-4328、miR-22-5p、miR-145-5p、miR-4324、let-7b-5p、m iR-181a-5p、m iR-27b-3p（倍数>10）（表2）。

表 2 人牙源性iPSCs重编程前后m iRNA差异表达交集（>10倍）Tab 2 Analysis of m icroRNAs differential expression intersections of human dental iPSCs before and after reprogramm ing (more than 10 fold)

3 讨论

m iRNAs是一类在转录后水平对目的基因表达进行调控的非编码RNA，在机体发育、细胞凋亡、体细胞重编程等方面都有极为重要的作用。早在1993年就发现了m iRNAs存在[8]，但近些年人们发现其在ESCs自我更新和多向分化中具有重要作用，m iRNAs在体细胞重编程过程中的机制研究方兴未艾。

3.1 m iRNAs与多潜能性

m iRNAs可以调控ESCs的多潜能性、自我更新和分化。当m iRNAs必需的加工蛋白Dicer/Drosha和RNA结合蛋白DGCR8耗尽后，m iRNAs会全部缺失，进而导致ESCs体外分化和增殖能力的缺陷，Dicer缺陷小鼠在发育早期死亡[9]。研究[10]证实，ESCs可以表达特定m iRNAs簇，转录因子如Oct-4、Sox2和Nanog结合到m iRNAs启动子，从而激发ESCs多个m iRNAs簇的表达。m iR-290簇包含多个种子序列与miR-302相同或相似的成熟m iRNAs，在ESCs中表达最为丰富，占未分化ESCs细胞m iRNAs的大多数。m iR-290簇其他成员（如m iR-291-3p、m iR-294、miR-295）与miR-302簇可以直接抑制细胞周期关键启动子，属于ESCs周期调节[11]。

m iRNAs不但可以维持ESCs的多潜能性，对其分化也起着重要的调节作用。ESCs诱导分化后某些miRNAs表达的特异性上调可以减少多潜能相关因子的表达，这是获得分化亚型的先决条件。如m iR-296抑制Nanog的表达，m iR-134和m iR-470的靶基因为多潜能因子Nanog、Oct-4、Sox2[12]，m iR-200c、m iR-203和miR-183抑制Sox2和K lf4的表达[13]，m iR-145抑制Oct-4、Sox2、K lf4的表达[14]。诱导分化后多潜能相关因子如Lin28的表达下调使得m iRNAs无需再加工，从而促进let7家族成员的成熟，这对ESCs分化的调节非常重要[15]。m iR-34a通过激活Notch和转移生长因子β（transforming grow th factor-β，TGF-β）信号通路，可促进SCAP成牙本质和成骨向分化[16-17]。m iR-224可通过调节离子转运体的表达以维持微环境pH值平衡，从而促进釉质矿化。

3.2 m iRNAs与重编程

iPSCs最早是过表达转录因子Oct-4/Sox2/K lf4/c-Myc建立的[1]，其他4种转录因子Oct-4/Sox2/Nanog/ Lin28或2种组合也能诱导产生iPSCs[2,18]，iPSCs的miRNAs表达谱系与ES细胞特征相似[19]。

人们首次在小鼠胚胎成纤维细胞中过表达m iR-290及Oct-4/Sox2/Klf4以诱导iPSCs的产生，发现miR-291-3p、m iR-294、m iR-295能增加重编程效率，而m iR-290簇其他成员则无此功效，如m iR-292-3p、miR-293[20]。

m iR-302家族与m iR-290家族成员有共同的种子序列，同样可以增加成纤维细胞的重编程效率，过表达人m iR-302、m iR-372与转录因子Oct-4/Sox2/ K lf4/c-Myc能促进人成纤维细胞多潜能性的诱导[12]。Anokye-Danso等[21]第一次发现无需其他转录因子，仅过表达m iR-302和m iR-367就能直接重编程小鼠和人体细胞，效率和速度均高于传统方法。Liao等[22]发现过表达m iR-106a-363、m iR-302-367可以加速间充质-上皮转化以增加iPSCs的诱导效率。直接转染成熟的双链m iR-200c、m iR-302、m iR-369也能获得有效的重编程，此方法无需病毒载体，可提供更为安全的重编程方法。

最近研究[23]又发现了与m iR-302簇种子序列相同或相近的3个m iR簇，即m iR-17-92、m iR106b-25和m iR106a-363，过表达m iR-106b-25家族成员m iR-93和m iR-106b能促进iPSCs的诱导。最近一项无偏倚研究[24]筛选了379种miRNAs，进一步证实了miR-290、m iR-302、m iR-17和m iR-25簇也能够促进重编程的效率。

人DPSCs和SCAP来源组织相近，细胞形态、增殖和分化能力相似，为了进一步了解这两种细胞在重编程时的特点，本研究利用CytoTune-iPS仙台病毒将人DPSCs和SCAP诱导为iPSCs，通过miRNAs芯片技术比较两种来源体细胞重编程前后miRNAs的差异表达情况，再交集分析，成功筛选出10种特异性表达的miRNAs：m iR-302e（上调）、m iR-29b-3p、m iR-181b-5p、m iR-4328、m iR-22-5p、miR-145-5p、m iR-432、let-7b-5p、m iR-181a-5p、m iR-27b-3p（下调）。这些m iRNAs大多与细胞周期、TGF-β信号通路、上皮-间充质转化有关。

3.3 m iRNAs与牙齿发育和再生

miRNA的正常表达对牙胚发育非常重要。M ichon等[25]通过m iRNA芯片技术研究发现，牙胚形成阶段表达的m iRNA有m iR-140、m iR-31、m iR-875-5p和m iR141，而m iR-689、miR-720、m iR-711和miR-455在细胞分化阶段表达，说明高RNA干扰（RNA interference，RNAi）通路活性和上皮m iRNA与牙齿发育息息相关，上皮m iRNA主要调节磨牙牙冠发育和牙尖形态。Kim等[26]通过m iRNA原位杂交研究发现，m iR-135a在牙胚发育蕾状期时在牙源性上皮和间充质中高表达，而帽状期和钟状期时仅在外釉上皮层、星网状层、牙囊和牙乳头中表达，内釉上皮层中无表达，进一步研究发现m iRNA-135a通过BMP信号通路调节牙齿形成。

m iRNAs促进或直接诱导重编程的机制尚不完全清楚，可能包括不同通路的靶向调节，如细胞周期和表观调节，还有上皮-间充质转化的调节，对本实验发现的差异m iRNAs尚需要通过m iRNA靶基因预测、m iRNA-基因本体论（gene ontology，GO）和miRNA-生物通路富集分析等进一步研究以阐明其在人牙源性细胞重编程过程中的作用机制。

[1] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J]. Cell, 2007, 131(5):861-872.

[2] Yu JY, Vodyanik MA, Smuga-Otto KA, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells [J]. Science, 2007, 318(5858):1917-1920.

[3] Hu K. All roads lead to induced pluripotent stem cells: the technologies of iPSC generation[J]. Stem Cells Dev, 2014, 23(12):1285-1300.

[4] Zhao B, Yang D, Jiang J, et al. Genome-w ide mapping of m iRNAs expressed in embryonic stem cells and pluripotent stem cells generated by different reprogramming strategies [J]. BMC Genomics, 2014, 15(1):488.

[5] Sharma A, Wu JC. M icroRNA expression profiling of humaninduced pluripotent and embryonic stem cells[J]. Methods Mol Biol, 2013, 936:247-256.

[6] Zou XY, Yang HY, Yu Z, et al. Establishment of transgenefree induced pluripotent stem cells reprogrammed from human stem cells of apical papilla for neural differentiation[J]. Stem Cell Res Ther, 2012, 3(5):43.

[7] Gronthos S, Arthur A, Bartold PM, et al. A method to isolate and culture expand human dental pulp stem cells[J]. Methods Mol Biol, 2011, 698:107-121.

[8] Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell, 1993, 75(5):843-854.

[9] Martinez NJ, Gregory RI. M icroRNA gene regulatory pathways in the establishment and maintenance of ESC identity [J]. Cell Stem Cell, 2010, 7(1):31-35.

[10] Marson A, Levine SS, Cole MF, et al. Connecting microRNA genes to the core transcriptional regulatory circuitry of embryonic stem cells[J]. Cell, 2008, 134(3):521-533.

[11] Card DA, Hebbar PB, Li L, et al. Oct4/Sox2-regulated m iR-302 targets cyclin D1 in human embryonic stem cells[J]. Mol Cell Biol, 2008, 28(20):6426-6438.

[12] Tay Y, Zhang J, Thomson AM, et al. M icroRNAs to nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation[J]. Nature, 2008, 455(7216):1124-1128. [13] Wellner U, Schubert J, Burk UC, et al. The EMT-activator ZEB1 promotes tumorigenicity by repressing stemnessinhibiting m icroRNAs[J]. Nat Cell Biol, 2009, 11(12): 1487-1495.

[14] Xu N, Papagiannakopoulos T, Pan GJ, et al. M icroRNA-145 regulates OCT4, SOX2, and KLF4 and represses pluripotency in human embryonic stem cells[J]. Cell, 2009, 137 (4):647-658.

[15] Melton C, Judson RL, Blelloch R. Opposing m icroRNA fam ilies regulate self-renewal in mouse embryonic stem cells[J]. Nature, 2010, 463(7281):621-626.

[16] Sun F, Wan M, Xu X, et al. Crosstalk between m iR-34a and notch signaling promotes differentiation in apical papilla stem cells (SCAPs)[J]. J Dent Res, 2014, 93(6):589-595.

[17] Wan M, Gao B, Sun F, et al. m icroRNA miR-34a regulates cytodifferentiation and targets multi-signaling pathways in human dental papilla cells[J]. PLoS One, 2012, 7(11):e50090. [18] Montserrat N, Ramírez-Bajo MJ, Xia Y, et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human renal proximal tubular cells with only two transcription factors, OCT4 and SOX2[J]. J Biol Chem, 2012, 287(29):24131-24138.

[19] W ilson KD, Venkatasubrahmanyam S, Jia F, et al. M icroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells[J]. Stem Cells Dev, 2009, 18(5):749-758.

[20] Gruber AJ, Grandy WA, Balw ierz PJ, et al. Embryonic stem cell-specific microRNAs contribute to pluripotency by inhibiting regulators of multiple differentiation pathways[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 42(14):9313-9326.

[212] Anokye-Danso F, Trivedi CM, Juhr D, et al. Highly efficient m iRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency[J]. Cell Stem Cell, 2011, 8(4): 376-388.

[22] Liao B, Bao X, Liu L, et al. M icroRNA cluster 302-367 enhances somatic cell reprogramm ing by accelerating a mesenchymal-to-epithelial transition[J]. J Biol Chem, 2011, 286(19):17359-17364.

[23] Li Z, Yang CS, Nakashima K, et al. Small RNA-mediated regulation of iPS cell Generation[J]. EMBO J, 2011, 30(5): 823-834.

[24] Pfaff N, Fiedler J, Holzmann A, et al. miRNA screening reveals a new miRNA family stimulating iPS cell Generation via regulation of Meox2[J]. EMBO Rep, 2011, 12(11):1153-1159.

[25] M ichon F, Tummers M, Kyyrönen M, et al. Tooth morphogenesis and ameloblast differentiation are regulated by micro-RNAs[J]. Dev Biol, 2010, 340(2):355-368.

[26] Kim EJ, Lee MJ, Li L, et al. Failure of tooth formation mediated by miR-135a overexpression via BMP signaling[J]. J Dent Res, 2014, 93(6):571-575.

（本文编辑 李彩）

Characterization of m icroRNAs profiles of induced p luripotent stem cells reprogrammed from human dental pulp stem

cells and stem cells from apical papilla

Tan Xiaobing1, Dai Qingyuan2. (1. Dept. of Oral Medicine, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, China; 2. Dept. of Cardiology, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, China)

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81360161); Yunnan Provincial Department of Education Science Foundation of China (2015Y153). Correspondence: Dai Qingyuan, E-mail: dqy0823@163.com.

ObjectiveTo compare characterization of m icroRNAs (m iRNAs) expression profiles of induced pluripotent stem cells (iPSCs) reprogrammed from human dental pulp stem cells (DPSCs) and stem cells from apical papilla (SCAP) and screen-specific microRNA.MethodsHuman DPSCs and SCAP were reprogrammed into iPSCs using a Sendai virus vector. Total RNA of human DPSCs-iPSCs and SCAP-iPSCs were extracted. m iRNAs were labeled and hybridized. Slides were scanned, and images were imported into GenePix Pro 6.0 for grid alignment and data extraction. Significant differentially expressed m iRNAs between the two groups were identified using fold change and P-value and were analyzed.ResultsBoth human DPSCs and SCAP were successfully reprogrammed into iPSCs. Among miRNA genes analyzed by miRNA microarray, 68 were differentially expressed by more than 10-fold in DPSCs-iPSCs; 37 of these genes were up-regulated, and 31 were down-regulated. In SCAP-iPSCs, 107 genes were differentially expressed by more than 10-fold; 68 were up-regulated, and 39 were down-regulated. In both cells, only m iR-302e was up-regulated, whereas 9 m iRNAs were down-regulated: m iR-29b-3p, miR-181b-5p, miR-4328, miR-22-5p, m iR-145-5p, miR-4324, let-7b-5p, miR-181a-5p, and miR-27b-3p.ConclusionMultiple m iRNAs participated in reprogramm ing of human DPSCs and SCAP into iPSCs. Most m iRNAs are related to cell cycle, transforming grow th factor-β signaling pathways and epithelial-mesenchymal transition.

induced pluripotent stem cells; dental pulp stem cells; stem cells from apical papilla; reprogramm ing; m icroRNAs

R 781

A

10.7518/hxkq.2017.03.008

2016-08-11；

2016-12-09

国家自然科学基金（81360161）；云南省教育厅基金（2-015Y153）

谭小兵，副主任医师，硕士，E-mail：txb042005@163.com

戴青原，副主任医师，博士，E-mail：dqy0823@163.com