于泽奇 衣泰龙 涂悦 杨小飒 江继鹏 董晓煜 张赛 程世翔

RIP3介导的坏死性凋亡在HT-22细胞牵张损伤模型中的作用

于泽奇1衣泰龙1涂悦1杨小飒1江继鹏1董晓煜2张赛1程世翔1

目的探讨受体相互作用蛋白3（RIP3）介导的坏死性凋亡在HT-22细胞牵张损伤模型中的作用及其机制。方法将HT-22细胞接种在Bioflex培养板，采用细胞损伤控制仪（CIC），设定损伤参数（阀门压力30 PSI、气体脉冲压力3.5～4.5 PSI、气体脉冲时间50 ms），建立HT-22细胞牵张损伤模型。分别采用数字全息显微镜（DHM）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、流式细胞术、western blot法检测牵张损伤后6 h Ctrl组、CIC组、GSK’872组间细胞形态差异，LDH浓度变化，细胞周期分布，RIP3/受体相互作用蛋白1（RIP1）/混合系列蛋白激酶样结构域（MLKL）、Akt/p-Akt/mTOR/p-mTOR、Caspase-8/X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）蛋白表达变化。结果与CIC组相比，应用GSK’872后细胞平均数量[（244.67±11.68）vs（190.67±15.28），t=4.865，P＜0.01]、细胞平均面积[（260.14±16.81）μm2vs（175.91±15.00）μm2，t=6.476，P＜0.01]有所增加，细胞平均厚度有所减小[（6.12±0.47）μm vs（8.04±0.48）μm，t=4.942，P＜0.01]；LDH浓度有所下降[（222.74±11.06）ng/l vs（275.93±12.26）ng/l，t=5.581，P＜0.01]；细胞周期有所恢复[Sub-G1：（0.33±0.15）%vs（6.51±0.63）%，t=16.530，P＜0.01；G0/G1：（46.67±2.96）%vs（33.04±7.07）%，t=3.085，P＜0.05]；能够降低 RIP3[（0.73±0.04）vs（1.09± 0.09），t=6.239，P＜0.01]、RIP1[（0.75±0.05）vs（0.91±0.05），t=4.211，P＜0.05]、MLKL[（0.56±0.03）vs（0.70± 0.04），t=4.785，P＜0.01]、Akt[（0.49±0.05）vs（0.77±0.05），t=6.763，P＜0.01]、p-Akt[（0.88±0.05）vs（1.06± 0.05），t=4.509，P＜0.05]、mTOR[（0.81±0.02）vs（0.90±0.05），t=2.813，P＜0.05]、p-mTOR[（0.65±0.05）vs（1.00±0.05），t=8.413，P＜0.01]、XIAP[（0.50±0.05）vs（0.73±0.05），t=5.814，P＜0.01]蛋白表达，并可促进 Caspase-8蛋白表达持续升高[（0.96±0.05）vs（0.75±0.05），t=5.351，P＜0.01]，差异具有统计学意义。结论RIP3介导的坏死性凋亡在HT-22细胞牵张损伤模型中起到重要作用，应用GSK’872可减轻HT-22细胞牵张损伤的程度，提示RIP3有可能成为将来临床上治疗颅脑创伤新的靶点。

颅脑创伤； 牵张损伤； 坏死性凋亡； 受体相互作用蛋白3； GSK’872； HT-22细胞

颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）是临床上常见预后凶险的危重病，其高致死率和致残率给患者家庭和社会带来沉重的负担，现已成为全球较严重的公共卫生问题[1,2]。降低颅脑创伤死亡率、致残率以及提高患者的生存质量是目前神经外科领域的研究热点[3]。近年来，坏死性凋亡在多种疾病中的作用越来越受关注，比如细菌感染，胰腺炎，动脉粥样硬化，脑、心肌、肠道炎症等[4-9]。坏死性凋亡的发生、调节、诱导及阻断机制是一个复杂的过程，涉及多种分子的表达及调控。其中受体相互作用蛋白3（receptor-interacting protein 3，RIP3）是调控细胞坏死性凋亡的关键分子，可磷酸化混合系列蛋白激酶样结构域（mixed lineage kinase domain like，MLKL），并最终导致细胞膜通透性改变，甚至细胞膜破裂[10,11]。但RIP3介导的坏死性凋亡与颅脑创伤之间的详细机制仍未完全清楚，因此本实验采用细胞损伤控制仪（cell injury controller，CIC）建立细胞牵张损伤模型，以模拟临床上颅脑创伤的发生，从而进一步探讨RIP3介导的坏死性凋亡在颅脑创伤中的作用及其机制。

材料与方法

一、实验细胞

小鼠海马神经元HT-22细胞购自上海慧颖生物科技有限公司，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基于培养箱（5%CO2，37℃）中常规培养。实验分组：Ctrl组（不予处理），CIC组（HT-22细胞CIC牵张损伤后，更换普通DMEM高糖培养基），GSK’872组 （HT-22细胞CIC牵张损伤后，更换含GSK’872浓度为3μmol/l的DMEM高糖培养基）。

二、仪器与试剂

CO2恒温三气培养箱（美国Thermo），细胞损伤仪 （美国Custom Design&Fabrication Ltd.），Bioflex细胞培养板（美国Flexcell），数字全息显微镜（digital holographic microscopy，DHM）（HoloMonitorTMM4，瑞典 Phiab），酶标仪 （美国 Thermo），乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司），流式细胞仪（FACSCallibur，美国BD），碘化丙啶（propidium iodide，PI）、Annexin V（美国 Life），垂直电泳槽（美国 Bio-Rad），半干转膜仪（美国Bio-Rad），化学发光成像系统 （AI600，美国GE），ECL显色试剂盒（美国GE），兔抗小鼠RIP3、RIP1、MLKL、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、X连锁凋亡抑制蛋白 (X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（美国Abcam），羊抗小鼠Caspase-8一抗（美国Santa Cruz），辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体（美国KPL），辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG抗体（美国KPL），BCA蛋白定量试剂盒 （北京康为公司），GSK’872（美国Millipore）。

三、建立CIC致HT-22细胞牵张损伤模型

将HT-22细胞以3×105/ml密度接种于Bioflex硅胶培养板中，待细胞汇合度达到85%以上时，将CIC细胞损伤仪输出端与Bioflex培养板紧密相连，设定参数如下：阀门压力为30 PSI，气体脉冲压力为3.5～4.5 PSI，气体脉冲时间为50 ms。在CIC损伤后6 h进行后续实验，对照组不予处理。

四、DHM形态学观察

用DHM随机选取HT-22细胞某一视野，拍摄细胞损伤各组间的形态学变化，并使用HoloStudio 1.8软件计算细胞平均数量、平均面积和平均厚度，取3次结果的平均值作为测定结果。

五、LDH浓度的测定

分别于细胞牵张损伤6 h吸取Ctrl组、CIC组、GSK’872组细胞培养上清液各10μl，加入到96孔板中，再将底物缓冲液与11.3 mmol/l氧化型辅酶Ⅰ以5∶1的比例混匀，每孔加入60μl混合液，37℃水浴15 min。加入50μl 2，4-二硝基苯肼溶液，与样本充分混合，37℃水浴15 min。最后加入150μl终止试剂（0.6 mmol/l NaOH），室温条件下，静置3～5 min，酶标仪440 nm波长处测定吸光值，根据标准曲线计算各样品释放的LDH浓度。

六、流式细胞术检测细胞周期

收集细胞牵张损伤后 6 h Ctrl、CIC、GSK’872组细胞，离心5 min（1 200 r/min），掉倒上清，加入预冷磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）4 ml，反复吹打，再以1 200 r/min离心5 min，掉倒上清，反复冲洗3次，用75%冰乙醇固定细胞，于-20℃冰箱中过液。次日，将固定好的细胞用预冷PBS洗涤3次，再用500μl PBS将细胞重悬后加入PI和RNase（终浓度分别为50、100μg/ml），于37℃条件下避光孵育30 min，最后用流式细胞仪进行检测。

七、Western blot

收集细胞牵张损伤后 6 h Ctrl、CIC、GSK’872组细胞，用RIPA蛋白裂解液裂解，收集上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，根据各组蛋白浓度取等量蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压120 V），待目的条带分离出来，停止电泳。再用半干转膜仪将蛋白转至硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane，NC）上（电压15 V），待转膜后将NC膜取出，蛋白面朝上，加入含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h。再分别加入RIP3、RIP1、 MLKL、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Caspase-8、XIAP一抗 （稀释比例均为1∶1 000），4℃孵育过夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，加入相应二抗（稀释比例均为1∶10 000），室温孵育1 h，再TBST洗膜3次，每次10 min。将ECL发光液A和B等体积混合，滴在NC膜上，用GE化学发光成像系统进行图像采集，GAPDH为内参，使用ScnImage软件对灰度值进行数据分析。

八、统计学分析

采用Graphpad Prism 6.0和SPSS 17.0软件进行数据分析，数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较行非配对样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、细胞牵张损伤后各组HT-22细胞形态学变化

光镜观察结果显示，Ctrl组细胞贴壁良好，结构正常呈梭形，生长密集并形成稠密的神经网络状分布；细胞牵张损伤后6 h，可见CIC组细胞皱缩，并出现脱落、漂浮现象。而应用GSK’872后，细胞形态较CIC组有所恢复，细胞形态较好，部分细胞重新伸展，详见图1。

DHM观察结果显示，与Ctrl组相比，细胞牵张损伤后细胞平均数量显著降低 [（190.67±15.28）vs（389.67±15.28），t=15.960，P＜0.01]，细胞平均面积显著变小[（175.91±15.00）μm2vs（394.99±21.20）μm2，t=14.612，P＜0.01]，细胞平均厚度显著升高 [（8.04± 0.48）μm vs（4.24±0.67）μm，t=8.006，P＜0.01]，差异有统计学意义；而应用GSK’872后，细胞平均数量（244.67±11.68，t=4.865，P＜0.01）、 细胞平均面积[（260.14±16.81）μm2，t=6.476，P＜0.01]、细胞平均厚度[（6.12±0.47）μm，t=4.942，P＜0.01]较CIC组均有所恢复，差异有统计学意义，详见图2A～2D。

二、LDH浓度的变化

LDH主要存在于细胞内，当细胞膜破裂时，释放到外周，因此测定LDH浓度可间接反映细胞损伤程度。本实验结果显示，与Ctrl组相比，细胞牵张损伤后6 h，LDH浓度显著升高 [（275.93±12.26）ng/l vs（51.68±7.08）ng/l，t=27.450，P＜0.01]， 而应用GSK’872后LDH浓度有所下降[（222.74±11.06）ng/l，t=5.581，P＜0.01]，差异有统计学意义。表明RIP3特异性抑制剂GSK’872能在一定程度上减轻细胞损伤程度，详见图3。

图1 光镜观察细胞牵张损伤后6 h Ctrl组、CIC组、GSK’872组细胞形态学变化（×100）

图2 数字全息显微镜观察细胞牵张损伤后6 h Ctrl组、CIC组、GSK’872组细胞形态学变化

图3 细胞牵张损伤后6 h Ctrl组、CIC组、GSK’872组乳酸脱氢酶浓度变化

三、细胞周期变化

与Ctrl组相比，细胞牵张损伤后6 h CIC组 Sub-G1峰、G2/M峰明显升高，同时G0/G1峰、S峰比例显著降低，提示细胞坏死比例显著升高。而应用GSK’872后，可见细胞各周期均有所恢复，提示应用RIP3抑制剂GSK’872能够在一定程度上减轻细胞牵张损伤程度，详见图4、表1。

图4 流式细胞术检测细胞周期

表1 细胞牵张损伤对HT-22细胞周期的影响（x±s，%）

四、Western blot结果

与Ctrl组相比，细胞牵张损伤后6 h CIC组RIP3、RIP1、MLKL表达显著升高[RIP3：（1.09±0.09）vs（0.60±0.04），t=8.532，P＜0.01；RIP1：（0.91±0.05）vs（0.74±0.04），t=4.720，P＜0.01；MLKL：（0.70±0.04）vs（0.55±0.03），t=5.390，P＜0.01]。而应用GSK’872后，与CIC组相比，RIP3、RIP1、MLKL表达量均有所下降，分别为 [RIP3：（0.73±0.04），t=6.239，P＜0.01；RIP1：（0.75±0.05），t=4.211，P＜0.05；MLKL：（0.56± 0.03），t=4.785，P＜0.01]，详见图5。

图5 RIP3、RIP1、MLKL蛋白表达变化

与Ctrl组相比，细胞牵张损伤后6 h CIC组Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表达显著升高[Akt：（0.77±0.05）vs（0.40±0.04），t=10.140，P＜0.01；p-Akt：（1.06±0.05）vs（0.76±0.04），t=8.264，P＜0.01；mTOR：（0.90±0.05）vs（0.78±0.04），t=3.258，P＜0.05；p-mTOR：（1.00±0.05）vs（0.64±0.04），t=9.680，P＜0.01]。而应用GSK’872后，与CIC组相比，Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表达量均有所下降，分别为 [Akt：（0.49±0.05），t=6.763，P＜0.01；p-Akt：（0.88±0.05），t=4.509，P＜0.05；mTOR：（0.81±0.02），t=2.813，P＜0.05；p-mTOR：（0.65±0.05），t=8.413，P＜0.01]，详见图6。

图6 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达变化

与Ctrl组相比，细胞牵张损伤后6 h CIC组Caspase-8表达显著升高[（0.75±0.05）vs（0.46±0.04），t=7.985，P＜0.01]，XIAP表达显著下降 [（0.73±0.05）vs（0.96±0.04），t=6.255，P＜0.01]；而应用 GSK’872后，与CIC组相比，Caspase-8表达持续升高（0.96± 0.05，t=5.351，P＜0.01），XIAP表达持续下降 （0.50± 0.05，t=5.814，P＜0.01），详见图7。

讨论

图7 Caspase-8、XIAP蛋白表达变化

颅脑创伤是由机械力作用而导致的原发性脑组织损伤，在伤后的数分钟至数天内出现颅内压升高、脑水肿、脑血流改变等继发性损害，进而加重脑组织的损害程度[12]。在继发性脑损伤中，目前研究较多的是坏死性凋亡通路[13]。以往人们认为坏死是在物理、化学及病原体等因素作用下所致的非程序性细胞死亡。随着研究的深入，人们逐渐认识到细胞坏死实际上也是有序性的，即坏死性凋亡[14]。其中RIP3是该通路的关键分子，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，可与 RIP1相互作用形成坏死复合体介导caspase非依赖性的细胞坏死。另一方面，RIP3的Ser227位点可通过磷酸化招募与活化其底物分子MLKL，磷酸化的MLKL募集PGAM5（线粒体中的一种蛋白）并使之磷酸化，最终作用于线粒体裂解蛋白Drp1，使其去磷酸化而激活，而后引发线粒体裂解以及活性氧的产生，导致细胞膜破裂、细胞坏死[15,16]。本实验中，HT-22细胞牵张损伤后，RIP3、RIP1、MLKL表达显著上升，而应用RIP3特异性抑制剂GSK’872，能够显著降低RIP3、RIP1、MLKL的表达，减轻细胞损伤程度，降低细胞死亡比例，提示RIP3特异性抑制剂GSK’872能够在一定程度上对神经细胞牵张损伤起到保护性作用，这为临床上治疗颅脑创伤提供了新的理论依据和目标靶点。

Akt是抑制神经元凋亡的一个关键激酶，mTOR是其下游激酶，调控蛋白的合成[17]。以往有研究指出，联合使用Akt和mTOR的抑制剂能够显著降低小鼠颅脑创伤模型中的细胞死亡，并改善小鼠的长期认知障碍[18]。在本研究中，笔者发现HT-22细胞牵张损伤后，Akt和mTOR发生磷酸化，同时表达量显著升高，而应用RIP3特异性抑制剂GSK’872后，Akt和mTOR的表达量有所减少，提示RIP3可能参与到Akt/mTOR信号途径中，并可对其进行调控[17]。

Caspase-8是细胞凋亡途径的核心分子，活化的Caspase-8会引起包括 Caspase-9在内的下游Caspase活化，进而导致凋亡的发生[19]。而XIAP是凋亡抑制剂，可抑制Caspase-8对下游Caspase活化过程中前结构域的去除，使下游Caspase不能活化从而抑制细胞凋亡的发生[20]。在本研究中，当HT-22细胞发生牵张损伤时，Caspase-8表达上调，XIAP表达减少。而值得注意的是，应用RIP3特异性抑制剂GSK’872后，一方面在一定程度上抑制细胞坏死性凋亡的发生，另一方面，明显地上调了Caspase-8的表达，并降低XIAP的表达，提示抑制RIP3的表达可在一定程度上抑制细胞坏死，并部分扭转到凋亡途径，这跟以往的研究不同[21]。

综上所述，RIP3介导的坏死性凋亡在HT-22细胞牵张损伤模型中起到重要作用，通过应用GSK’872阻断RIP3的表达可对神经元细胞牵张损伤起到一定的保护性作用。但临床上颅脑创伤与RIP3介导的坏死性凋亡之间的关系究竟如何，还有待进一步研究，这将为临床上治疗颅脑创伤提供新的研究方向和目标靶点。

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（本文编辑：张丽）

于泽奇,衣泰龙,涂悦,等.RIP3介导的坏死性凋亡在HT-22细胞牵张损伤模型中的作用[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2017,3(3)：159-165.

·消息·

第十二届中国医师协会神经外科医师年会

12th Annual Meeting of Chinese Congress of Neurological Surgeons

尊敬的全国神经外科同仁：

中国医师协会神经外科医师分会从建立之日起，就把维护医师的合法权益和推进我国专科医师培训作为首要责任，也把全国神经外科医师群体真正地团结成为一个大家庭。一年一度的全国代表大会成了全国神经外科医师共同的节日！2017年6月23-25日，我们将在武汉欧亚会展国际酒店迎来第十二届全国年会！

在凸显中国医师协会神经外科医师分会“维权，自律，教育，交流”的宗旨下，此次大会将呈现给全国代表丰富多彩的内容。形式上，有会前多个亚专科实战解剖和操作学习班，大会邀请全国知名专家作精彩的大会报告，开设多个神经外科亚专科分会场，以及青年医生演讲比赛。在内容上，除了学术交流，还有政策解读，共识探讨，人文思考，历史回顾等。希望广大的代表踊跃投稿参会作报告！

会议举办地湖北武汉，九省通衢，交通便利。既可食武昌鱼，亦可万里长江横渡，还可一登黄鹤楼，极目楚天舒！湖北不仅有神秘恩施，雄伟三峡，巍峨武当等美不胜收的自然风光，同时人文荟萃，她是巴楚文化的发源地、禅宗文化的祖庭地、首义文化的承载地……届时您将有机会领略独具魅力的荆楚大地！

主办单位：中国医师协会

中国医师协会神经外科医师分会

承办单位：华中科技大学武汉协和医院

协办单位：首都医科大学宣武医院

刘承基中国神经外科医师基金

北京市王忠诚医学基金会

会议主席：凌锋

执行主席：赵洪洋

详情点击大会官网：http：//ccns.cmdamt.org/2017/index

中国医师协会神经外科医师分会

Effects of necroptosis induced by RIP3 in stretch injury model of HT-22 cells

Yu Zeqi1,Yi Tailong1,Tu Yue1,Yang Xiaosa1,Jiang Jipeng1,Dong Xiaoyu2Zhang Sai1,Cheng Shixiang1.1Neurology and Neurosurgery Hospital,Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People’s Armed Police Force(PAP),Tianjin 300162,China;2Medical Unit of Three Detachment of Beijing Armed Police Corps, Beijing 100621,China

Cheng Shixiang,Email:shixiangcheng@vip.126.com

Objective To investigate the effects of necroptosis induced by receptor-interacting protein 3 (RIP3）on stretch injury model of HT-22 cells and its mechanisms.MethodsHT-22 cell lines were seeded with Bioflex cell plate,and stretch injuries with 30 psi for the regulator with a 50 msec pulse resulting in 3.5～4.5 peak injury pressure by cell injury controllerⅡ(CIC)instrument.The morphological changes of HT-22 cells were assessed by digital holographic microscopy(DHM),the degree of injury was detected by lactate dehydrogenase(LDH)assay,the cell cycle was detected withFlow cytometry and the expression of RIP3/RIP1/mixed lineage kinase domain like(MLKL),Akt/p-Akt/ mTOR/p-mTOR and Caspase-8/X-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP)were detected by Western Blot assay at 6 h post-CCI among Ctrl,CIC and GSK’872 groups.ResultsCompared with the CIC group,cells treated with GSK’872 exhibited an increase in number[(244.67±11.68)vs(190.67±15.28), t=4.865,P＜0.01]and area [(260.14±16.81)μm2vs(175.91±15.00)μm2,t=6.476,P＜0.01],however,a reduction in thickness[(6.12±0.47)μm vs(8.04±0.48)μm,t=4.942,P＜0.01]with DHM.In the presence of GSK’872,the leakage of LDH was sharply decreased compared with the CIC group [(222.74±11.06) ng/l vs(275.93±12.26)ng/l,t=5.581,P＜0.01].What’s more,GSK’872 could convert the alteration of cell cycle and cell death[Sub-G1：(0.33±0.15)%vs(6.51±0.63)%,t=16.530,P＜0.01;G0/G1(46.67±2.96)%vs (33.04±7.07)%,t=3.085,P＜0.05]compared to the CIC group.Furthermore,GSK’872 treatment could significantly decrease the levels of RIP3[(0.73±0.04)vs(1.09±0.09),t=6.239,P＜0.01],RIP1[(0.75±0.05)vs (0.91±0.05),t=4.211,P＜0.05],MLKL[(0.56±0.03)vs(0.70±0.04),t=4.785,P＜0.01],Akt[(0.49±0.05) vs(0.77±0.05),t=6.763,P＜0.01],p-Akt[(0.88±0.05)vs(1.06±0.05),t=4.509,P＜0.05],mTOR[(0.81± 0.02)vs(0.90±0.05),t=2.813,P＜0.05],p-mTOR[(0.65±0.05)vs(1.00±0.05),t=8.413,P＜0.01],XIAP[(0.50± 0.05)vs(0.73±0.05),t=5.814,P＜0.01],but increase the level of Caspase-8[(0.96±0.05)vs(0.75±0.05),t= 5.351,P＜0.01]compared with CIC group.ConclusionNecroptosis induced by RIP3 may play an important role in stretch injury model of HT-22 cells,what’s more,GSK’872 could reduce the degree of injury after CIC,which reveals that RIP3 may be a new targetfor clinicaltreatmentof TBIin the future.

Traumatic brain injury; Stretch injury; Necroptosis; Receptor-interacting protein 3;GSK’872;HT-22 cells

2017-05-05）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.03.008

国家自然科学基金项目（31200809）；武警部队后勤科研项目（WJHQ2012-20）；军队技术产品研究重大项目（AWS15J001）；天津市科技计划项目（15ZXLCSY00040）

300162 天津，武警后勤学院附属医院脑科医院1；100621 北京，北京武警总队三支队卫生队2

程世翔，Email：shixiangcheng@vip.126.com