孙文采

DOI：10.16660/j.cnki.1674-098X.2017.11.244

摘 要：基因组靶向修饰效率低是目前基因治疗的难题之一。近年来基因组定点修饰技术得到了飞速的发展，为克服这一难题提供了新的途径。锌指核酸酶（ZFNs）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）或规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）技术可以对DNA进行双链切割，通过细胞的同源重组修复机制，能够实现对靶基因进行高效的定点修饰。该文主要针对这三种基因修饰工具，分别对其作用原理，在动物细胞基因定点修饰中的应用及其局限性进行综述，以期为构建动物疾病模型，治疗遗传疾病提供新思路。

关键词：基因定点修饰 基因治疗 ZFNs TALENs CRISPR/Cas9

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2017）04（b）-0244-02

基因组定点修饰技术是指利用基因工程的方法对基因组进行靶向改造的技术。基因组定点修饰技术为畜牧基因的改良、基因功能的研究以及遗传性疾病治疗提供了有力的工具，因此该技术对于构建动物疾病模型，治疗遗传疾病都具有重要的意义。基因组定点修饰技术的发展经历了一个漫长过程。起初，科学家们通过同源重组的方法进行基因组修饰，但是自然条件下发生同源重组的几率非常低，只有10-6 [1]。为了提高基因组定点修饰的效率，科学家们建立了Cre/loxP[2]、PiggyBac转座子系统[3]，PhiC31整合酶系统[4]等方法。Cre/loxP可以进行条件性基因敲除或者敲入，目前主要应用于转基因动物模型的制备，但是首先要在基因组中插入loxP序列，如何提高loxP插入的效率仍然是一个亟待解决的问题。PiggyBac转座子系统和PhiC31整合酶系统都可以实现外源基因的特异性整合，但是PiggyBac转座子系统会破坏细胞的内源基因，而PhiC31整合酶系统不能进行定点整合。近年来兴起的基因修饰技术如锌指核酸酶（ZFNs）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）或规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）技术，克服了先前基因组定点修饰技术的缺陷，可以对DNA进行双链切割，通过细胞的同源重组修复机制，能够实现对靶基因进行高度特异和高效的定点修饰，为动物细胞基因组的定点修饰提供了新的途径。该文就这三种基因修饰方法的作用原理、在动物基因组定点修饰中的应用进行综述，并分别剖析了其应用局限性，展望了这三大基因组修饰系统的应用前景，以期为构建动物疾病模型，治疗遗传疾病提供新思路。

1 锌指核酸酶（ZFNs）

1.1 ZFNs的作用原理

锌指核酸酶单体主要包括两部分：位于C末端的核酸酶结构域FokI和位于N端的特异性识别DNA的锌指蛋白 （zinc fnger protein， ZFP）。ZFP通常由3～6个锌指组成折叠形成ββα的二级结构，每个锌指能够识别基因组中3bp长的DNA序列，因此单个ZFN可以识别9～18个碱基。当两个锌指核酸酶单体分别与基因组中的特定序列结合且两个锌指核酸酶单体的分子间距在6～8bp时，FokI会形成二聚体发挥DNA切割活性。将DNA双链切断形成双链断裂切口。细胞会启动DNA修复机制，主要包括非同源重组末端连接修复和DNA同源重组修复。前者会造成靶位点附近小片段的随机插入或者缺失引起基因敲除；后者可以实现基因的敲入或者敲除。

1.2 ZFNs在动物细胞基因定点修饰中的应用及其局限性

目前，锌指核酸酶已经在人类胚胎干细胞、果蝇、斑马鱼、大鼠、小鼠模式动物中实现了基因组的定点修饰。同时，锌指核酸酶在遗传疾病治疗中也发挥了重要作用。2005年，美国的Sangamo公司利用锌指核酸酶对免疫缺陷相关基因Il2Rγ进行了定点修复。Sangamo公司利用锌指核酸酶实现了CCR5基因的定点修饰，从而提高T淋巴细胞对HIV病毒的抵抗力。2011年，Soldner等利用锌指核酸酶对α-synuclein的点突变位点进行定点修饰，从而对帕金森疾病进行疾病治疗。同年，Yusa利用锌指核酸酶造成DNA双链断裂然后利用同源重组的方法将α1-抗胰蛋白酶导入到细胞中在小鼠中实现了α1-抗胰蛋白酶缺陷引起的肝病的基因治疗。2014年，Genovese等利用锌指核酸酶在造血干细胞中插入Il2RG基因的cDNA，在免疫缺陷小鼠中重建造血系统。锌指核酸酶在基因治疗中发挥了重要作用，但是该技术本身仍然存在局限性，比如构建难，周期长，价格昂贵以及脱靶会导致细胞毒性。这些局限性限制了锌指核酸酶在基因治疗中的广泛应用。

2 类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）

2.1 TALENs的作用原理

TALENs的构造类似于ZFN，主要是由DNA结合域和分子剪刀“Fok I”组成。不同的是：TALENs的DNA结合域是一段很长的重复氨基酸序列，是由1.5～33.5个TALE单元组成。每个TALE单元包括33～35个氨基酸组成，不同的TALE单元之间只有12，13位的氨基酸是不同的，其决定DNA碱基的识别点。目前为止，只有五种TALEN单元，其余DNA的对应关系分别为：氨基酸HD特异识别碱基C、氨基酸NI特异识别碱基A、氨基酸NN特异识别碱基G或A、氨基酸NG特异识别碱基T、氨基酸NK可以识别碱基A、T、C、G中的任一种。因此，TALE单元与DNA碱基之间有更好地对应关系。每个TALEN单体识别的靶序列長度一般在14～20个碱基，因此相比于ZFN，TALENs识别靶点的特异性更强，脱靶率更低。TALENs的工作原理类似于ZFNs，当FokI 形成二聚体时切开DNA双链，FokI的切割位点位于两个TALEN单体识别的靶标序列之间，此间隔一般在15～30 bp之间。DNA双链断裂后，细胞启动修复体制，利用同源重组或者非同源重组末端连接修复进行基因修饰。

2.2 TALENs在動物细胞基因定点修饰中的应用及其局限性

目前为止，TALENs不仅在果蝇、蛔虫、斑马鱼、青蛙、大鼠和猪等模式动物中实现了基因组的定点编辑，而且在斑马鱼和人的基因组中实现了定点插入。2012年，Sun利用TALENs和同源片段对缺陷型β珠蛋白基因进行定点修饰，使其恢复到正常序列，进而治疗镰刀型红细胞病。2013年，Wang等利用TALENs对小鼠胚胎干细胞基因组进行修饰，获得了Sry和Uty的突变的基因修饰小鼠。2014年，Liu等利用TALENs技术在猴的身上成功实现了Rett综合征和孤独症相关的基因Mecp2的突变。2014年，Park等利用TALENs技术在hiPSC中成功将含有F8基因的140 kb染色体片段倒置。2015年，Menger等在特异性识别巨细胞病毒的T细胞中利用TALEN敲除糖皮质激素受体的基因，提高了造血干细胞移植的存活率。TALENs技术相比于ZFNs有一定的优势，但是其本身仍然存在一些问题尚未解决，比如：TALENs重复序列在什么长度下活性最高，识别特异性最好；TALENs的脱靶率和细胞毒性虽然比ZFNs小但是仍未得到彻底解决。

3 规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）

3.1 CRISPR/Cas9的作用原理

CRISPR/Cas9的结构主要包括三部分：trans-activating crRNA（tracrRNA）、DNA内切酶Cas9蛋白编码基因和CRISPR RNAs（crRNA）基因座。CRISPR主要由25～50 bp的同向重复序列（repeat）和26～72 bp的间隔序列（spacer）构成，其中重复序列被间隔序列间隔。CRISPR/Cas9的作用机制为：外源DNA作为短的回文重复序列整合在CRISPR基因组中，在RNaseIII催化作用下加工成熟，和tracrRNA通过碱基配对结合形成双链RNA结构，共同指导Cas9蛋白在与crRNA引导序列互补的位点进行DNA双链切割，造成双链断裂。细胞会启动DNA相应的修复模式。与ZFN和TALEN等相比，CRISPR/Cas9具有打靶效率高、操作简单、成本低、适用范围广的优点。

3.2 CRISPR/Cas9在动物细胞基因定点修饰中的应用及其局限性

目前，CRISPR/Cas9已经在多种细胞和模式动物中实现了基因组修饰。2013年，两个实验室同时利用CRISPR/Cas9系统在人类细胞中实现了基因组的靶向修饰。随后，Wang 和Yang等利用CRISPR/Cas9系统成功实现了对多基因的同时修饰，获得了转基因小鼠。2014年，Xie等利用CRISPR/Cas9系统成功的矫正了诱导多能干细胞基因组中人β血红蛋白基因的突变，为β地中海贫血病的基因治疗提供了一种有效的策略。同年，Feng等利用CRISPR/Cas9定点敲除与肿瘤的发生发展密切相关的基因CDK11，成功抑制骨肉瘤细胞的增殖。2014年，Yin等利用CRISPR/Cas9系统在小鼠中成功实现了对突变基因FAH的纠正修复，为遗传酪氨酸血症的基因治疗提供了有效方法。2015年，Yang等利用CRISPR-Cas9技术在猪基因组中将包括猪内源性逆转录病毒（PERV）的病毒在内的62个重复的基因失活，促进了异种器官移植的进一步发展。CRISPR-Cas9基因组修饰技术对基因治疗的发展具有重要意义，但是其本身仍然存在一些问题没有解决。比如：CRISPR/Cas9基因编辑技术对真核生物是否存在细胞毒性？CRISPR/Cas9未来如何在整体水平进行应用？

4 展望

基因组定点修饰技术基础研究和临床应用均有重大意义。ZFN、TALEN、CRISPR等新兴的基因编辑技术使基因敲除和插入技术变得更为简便快捷，这对研究基因功能和实现基因治疗非常重要。目前，许多模式动物的单基因疾病模型尚未建立，利用这些新兴技术在模式动物的胚胎干细胞中进行基因敲除或者定点修饰，对于研究该基因的功能和某些疾病的致病机理具有重要意义；另一方面，基因治疗是根治遗传性疾病的最直接的办法，但是由于同源重组效率低下，基因组修饰技术不够完善，阻碍了这一治疗方法的广泛应用。近年新兴的这三大基因组修饰系统都大大提高了基因编辑的效率，为人类疾病的治疗带来崭新的机遇。在今后的发展中，如果能够针对这些基因编辑工具引起的免疫反应和脱靶效应建立安全、有效的检测手段；减弱细胞毒性；优化基因导入系统，一定能够极大地促进基因治疗的广泛应用。虽然这些基因修饰技术仍然存在许多问题，但是相关研究的最新进展表明该技术的应用将渐趋成熟，发展也更全面。利用这些技术开展的基因治疗将会对肿瘤及人类遗传性疾病的治疗带来重大影响。

参考文献

[1] Cathomen T， Joung JK. Zinc-finger nucleases： the next generation emerges. Molecular therapy[J].The journal of the American Society of Gene Therapy， 2008（16）：1200-1207.

[2] Du ZW， Hu BY， Ayala M， Sauer B， Zhang SC. Cre recombination-mediated cassette exchange for building versatile transgenic human embryonic stem cells lines[J]. Stem Cells，2009（27）：1032-1041.

[3] Chen YT， Furushima K， Hou PS， Ku AT， Deng JM， Jang CW， et al. PiggyBac transposon-mediated， reversible gene transfer in human embryonic stem cells[J]. Stem cells and development，2010（19）：763-771.

[4] Monetti C，Nishino K，Biechele S， Zhang P，Baba T，Woltjen K，et al. PhiC31 integrase facilitates genetic approaches combining multiple recombinases[J].Methods，2011（53）：380-385.