饶珊珊+邵松军+张程+叶贤伟+林洁如+曾令萍+张湘燕

摘要：目的 观察细胞外基质蛋白1（ECM1）在气道狭窄患者的气道瘢痕组织中的表达，探讨其意义。方法 收集气道瘢痕增生致气道狭窄患者的瘢痕组织和同时期正常人气道粘膜组织，运用实时荧光定量PCR检测ECM1基因表达，Western blot检测ECM1、表皮生长因子受体（EGFR）、磷酸化表皮生长因子受体（p-EGFR）蛋白水平。结果 与正常人比较，气道瘢痕增生患者瘢痕组织的ECM1基因表达及蛋白水平均明显升高（P<0.01），p-EGFR蛋白水平明显上升（P<0.01）。结论 ECM1与气道瘢痕增生关系密切，表达增多，并激活EGFR。

关键词：气道狭窄；瘢痕增生；细胞外基质蛋白1

近年来，气道瘢痕狭窄病例日益增多，严重者影响肺通气功能，甚至出现窒息性呼吸困难。气道瘢痕与皮肤瘢痕疙瘩的病理改变有相似性。有研究发现，细胞外基质蛋白1（extracellular matrix protein 1，ECM1）在瘢痕疙瘩中表达明显升高[1]。但在气道瘢痕中尚无研究报道。为观察ECM1与气道瘢痕增生的关系，探讨气道瘢痕的病理生理改变，我们收集了2012年～2014年在贵州省人民医院就诊的气道瘢痕狭窄患者的瘢痕组织和同时期正常人气道粘膜组织，运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot方法从基因和蛋白两个水平来探讨ECM1在气道瘢痕组织中的表达及意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 ①瘢痕组：选择2012年8月～2014年10月在我院就诊的气道瘢痕狭窄患者10例，男6例，女4例，年龄18～56岁，经纤维支气管镜活检钳取材或胸外科手术取材取得氣道瘢痕组织；②正常组：选择同时期在我院行纤维支气管镜检查的正常人10例，男5例，女5例，年龄20～60岁，经纤支镜活检取得气道粘膜组织。两组人员均排除恶性肿瘤及慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化等慢性呼吸系统疾病，年龄、性别差异无统计学意义。该研究方案通过本院伦理委员会批准，入选者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1 qRT-PCR检测ECM1基因表达水平 Trizol（Invitrogen）一步法提取组织总RNA，逆转录为cDNA。ECM1、β-actin的mRNA引物由上海生工公司合成。ECM1上游引物5′-GACCTGCCATTTCCA GAACAG-3′，下游引物5′-GGGACCACACAGATCATTGATG-3′；β-actin上游引物5′-ACCACCATGTACCCAGGCAT-3′，下游引物′-CCGGACTCATCGTACTCCTG-3′。PCR扩增用iQTM SYBR○R GREEN Supermix完成，Bio-Rad CFX 96TM荧光定量PCR分析系统行Realtime PCR。

1.2.2 Western blot检测ECM1、表皮生长因子受体（EGFR）、磷酸化表皮生长因子受体（p-EGFR）蛋白水平 SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5% BSA封闭1 h，一抗β-actin（博奥森，1∶400）、ECM1（abcam，1∶1000）、EGFR（abcam，1∶1000）、p-EGFR（CST，1∶1000）孵育过夜（4℃），二抗孵育2 h（室温），ECL发光显色，Bio-Rad凝胶成像系统扫描胶片，Quantity one 软件分析各目标条带灰度值，以β-actin为内参，目标蛋白表达水平以目标蛋白/β-actin比值表示。

1.3统计学分析 采用SPSS19.0统计软件进行数据统计分析，数据均以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测ECM1基因表达水平 结果显示，瘢痕组ECM1基因表达较正常组明显增多（P<0.01），见图1。

2.2 Western blot检测ECM1、EGFR、p-EGFR蛋白水平情况 结果显示，瘢痕组ECM1、p-EGFR蛋白水平较正常组明显升高（P<0.01），EGFR蛋白水平在两组间差异无统计学意义（P>0.05），见图2。

3 讨论

近年来，气管狭窄的患病率不断上升，究其原因，主要是由于气管插管、气管切开术后气道纤维瘢痕组织增生或者支气管内膜结核等疾病气道粘膜修复过度导致的气道瘢痕增生所致。气道瘢痕组织增生及挛缩不仅会导致气管或支气管狭窄，还可引起阻塞性肺炎、肺不张和呼吸困难，严重者可发生窒息。目前对于气道瘢痕增生的发病机制及病理过程认识并不清楚，缺乏有效的治疗药物，虽然可以通过纤支镜介入技术进行缓解性治疗，但存在复发率高、复诊率高的问题，需要寻找新的治疗手段。

ECM1是从鼠的成骨基质细胞系MN7中分离出来的一种分泌性糖蛋白[2]，分子量为85kDa。重组ECM1能够促进内皮细胞增殖和血管生成[3]。大量研究已表明，ECM1在肿瘤的发生、发展及转移等方面有重要作用，尤其是能够影响肿瘤细胞的增殖、转移[4]。ECM1通过激活EGFR信号通路调控癌细胞的增殖，在此过程中，ECM1可与基底膜聚糖结合，诱导成纤维细胞生长因子2（FGF2）等细胞因子增多而促进肿瘤的生长、进展[5-7]。

本研究发现，气道狭窄患者的局部气道组织中，ECM1的基因转录水平和蛋白表达水平均明显上升，提示ECM1与气道瘢痕增生关系密切，为探索气道瘢痕增生的发病机制提供了新的有意义的实验依据。同时，本研究还发现在气道纤维瘢痕组织中，EGFR磷酸化的水平明显升高，可能因此激活EGFR信号通路，导致气道上皮细胞或成纤维细胞的增殖，从而促进纤维瘢痕组织的形成和发展，有待于进一步研究探索明确。有研究发现敲低ECM1或用抗ECM1的抗体处理肿瘤细胞后，EGFR通路受到抑制，由此能够遏制细胞增殖[5，8]。提示在气道瘢痕增生疾病中，可以以ECM1为靶点进行深入探索研究，观察对瘢痕增生的影响，以期发现新的治疗手段。

参考文献：

[1]郑辉，成羿.病理性瘢痕组织的发生机制研究进展[J].浙江临床医学，2012，14（01）：117-120.

[2]Donald E，Kalsched.Revisioning Fordham's Defences of the self in light of modern relational theory and contemporary neuroscience[J].The Journal of analytical psychology，2015，60（4）：477-496.

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[6]屈艳，张崇，贾岩龙，等.大黄酸通过抑制miR-21而干预TGF-β1/Smad通路并减轻博莱霉素所致大鼠肺纤维化[J].中国病理生理杂志，2017，33（01）：149-153.

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[8]Lee KM，Nam K，Oh S，et al.ECM1 promotes the Warburg effect through EGF-mediated activation of PKM2[J].Cellular Signalling，2015，27（2）：228-235.