（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

鄱阳湖与青海湖地区野鸟H9N2亚型禽流感病毒的生物学特性

蒋文明，侯广宇，彭 程，王素春，李金平，陈继明

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

为了解我国野鸟中H9N2亚型禽流感病毒的分布与特征，2015—2016年对鄱阳湖与青海湖地区野鸟中的H9N2病毒进行监测，结果共分离到12株H9N2亚型禽流感病毒。对分离的病毒进行HA和NA基因序列测定、受体分析和SPF鸡、Balb/c小鼠的感染性试验，结果显示：12个分离株的HA裂解位点基序均为PSRSSR/ GLF，符合低致病性禽流感病毒的分子特征；HA蛋白受体结合位点处第226位氨基酸残基为亮氨酸（L），具有结合人样流感病毒受体的分子特征；受体结合试验表明，分离毒株既能结合禽样受体，也能结合人样受体；SPF鸡攻毒试验表明，分离株为低致病性毒株；Balb/c小鼠的感染性试验表明，分离株只在小鼠的上呼吸道鼻甲和肺中有限复制，未见明显临床症状。

禽流感病毒；H9N2；野鸟感染性

野鸟在禽流感病毒（Avian inf l uenza viruses，AIVs）进化和传播过程中发挥重要的作用，是AIVs的自然储存库[1-2]，H1～H16和N1～N9亚型的A型AIVs都曾在野鸟中被发现[3]。通常，野鸟感染低致病性AIVs后无症状，或仅表现出亚临床症状[4]。随着野鸟的迁徙，AIVs可被长距离传播。AIVs多定植于迁徙水禽的肠道中，因此水禽粪便中含有的高浓度病毒[5-6]，可通过粪-口途径或污染的水，在野生水禽之间或野生水禽与家禽之间传播[2，7]。

H9N2 AIVs为低致病性病毒，只引起家禽的温和临床症状。但是自20世纪90年代末以来，我国发生了多起人H9N2感染病例。一些H9N2病毒表现出人流感病毒样受体特性因此H9N2亚型AIVs被认为是引起人流感大流行的可能毒株之一。野鸟在一些新型流感事件中被认为发挥了主要作用[2]。研究发现，19世纪出现的人流感大流行毒株中含有来自于野鸟源AIVs的基因片段[8]。2013年出现的新型重组人H7N9流感病毒，含有来自于韩国野鸭源AIVs的NA基因，其内部基因都来自于禽源H9N2病毒[9]。2014年在江西省出现的人新型H10N8病毒[10]中的H10基因后来被证明是通过鄱阳湖迁徙的野鸭传入到家养鸭中的，其内部基因也都来自于禽源H9N2病毒[11]。因此，监测野鸟中的AIVs，对于理解潜在流行毒株的进化和出现十分重要。本研究于2015—2016年对鄱阳湖和青海湖地区的野鸟进行了H9N2亚型禽流感监测，并对分离的H9N2病毒进行了生物学特性分析，以期了解该亚型病毒在野鸟中的分布、进化和生物学特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源。2015—2016年在鄱阳湖和青海湖收集野鸟粪便，置于含抗生素的PBS-甘油中，低温运输、保存。

1.1.2 主要试剂。QIAamp Viral RNA Mini Kit，购自Qiagen公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit，购自Vazyme公司；DNA胶回收试剂盒、pMD19-T载体、质粒提取纯化试剂盒、α2,3-sialidase，购自Takara公司；SPF鸡胚，购自济南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 引物设计

扩增HA和NA基因的引物，根据已发表的文献合成[12]。

1.3 病毒分离

将收集的粪便加入含抗生素的PBS后捣碎，12 000 r/min离心5 min，取上清接种10日龄SPF鸡胚，37 ℃孵化，96 h后测定鸡胚尿囊液的血凝效价，血凝阴性者继续盲传3代。

1.4 RNA提取

根据QIAamp Viral RNA Mini Kit操作说明，提取病毒RNA，置-70 ℃保存备用。

1.5 一步法RT-PCR

按照HiScript II One Step RT-PCR Kit说明书和已发表的相关文献，进行反应体系的配置和反应条件的设置。利用DNA胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，然后与pMD19-T载体连接，将阳性重组质粒送上海生工进行测序鉴定。

1.6 HA基因序列与遗传进化分析

利用Clustal W软件和MEGA软件，对HA基因序列进行谱系分析，具体方法和参数设置参考文献[13]。

1.7 受体结合试验

具体方法参考文献[14]。用PBS制备10%的鹅红细胞悬液（Goose red blood cell，GRBC），每100 μL悬液用1.25 U α2,3-sialidase 37 ℃处理1 h，用PBS洗涤2次后配成0.5%的鹅红细胞悬液。同样制备未经处理的0.5%的鹅红细胞悬液。将病毒2倍比稀释后，分别与2种等量的0.5%的鹅红细胞悬液混合作用，记录发生完全凝集的病毒最大稀释度。

1.8 致病性试验

1.8.1 SPF鸡。选取2株病毒P347和QY1139，将其稀释10倍后，经静脉无菌接种8周龄SPF鸡，每天观察有无临床症状，并采集咽、肛拭子进行病毒分离。观察期结束后，剖检观察组织病变。

1.8.2 Balb/c小鼠。将EID50为106的病毒经鼻腔接种6周龄Balb/c小鼠，分别于感染后3 d和5 d，处死5只小鼠。剖检观察病变，并采集肺、鼻窦、脾和脑组织样品进行病毒滴定。

2 结果

2.1 病毒分离与鉴定

从800份粪便样品中分离出12份血凝阳性毒株。对分离毒株的HA和NA基因进行RT-PCR扩增，获得与预期相符的目的片段（图1）。HA和NA片段测序分析结果表明，所有毒株均为H9N2亚型AIVs。

图1 HA基因的RT-PCR扩增

2.2 HA基因遗传进化分析

本次分离到的12株野鸟源H9N2病毒都属于第9.4.2.5分支（以A/chicken/Guangxi/55/2005为代表）。该分支也属于目前在我国主要流行的H9亚型禽流感谱系。本研究中2015年分离自鄱阳湖的5株病毒（P130、P224、P347、P448、P549）与越南的A/muscovy duck/Vietnam/ LBM675/2014进化关系较近 ；2016年分离自青海湖的7株病毒（QY1009、QY1123、QY1124、QY1128、QY1134、QY1139、QY1140）与A/chicken/ Shanghai/06/2015、A/wild chicken/Shanghai/C1/2014进化关系较近（图2）。

氨基酸序列分析结果表明，12株H9N2病毒的HA裂解位点基序为“PSRSSRGLF”，仅有2个碱性氨基酸，符合低致病性AIVs的分子特征。HA受体结合位点分析结果表明，所有毒株的第226位氨基酸均为亮氨酸（L），与人流感相同，具有人样受体特性。NetNGlyc 1.0 Server预测分析结果表明，P130、P224、P347在29、141、218、298、305、313、492位含有7个潜在的糖基化位点，其他毒株在218位少了1个糖基化位点。

2.3 受体结合特性

12株病毒既能与未处理的鹅红细胞反应，也能与处理过的鹅红细胞反应。与前者相比，处理后的病毒HA滴度下降了22%～40%（表1），说明这些H9N2亚型AIVs同时能结合α2,3-唾液酸和α2,6-唾液酸。

2.4 致病性

图2 12株野鸟源H9N2病毒HA基因进化分析

表1 12株H9N2病毒与α2,3-唾液酸酶处理的鹅红细胞（GRBC）反应前后HA滴度的变化

将P347和QY1139静脉接种SPF鸡后，在观察期内，SPF鸡均无明显的临床症状，静脉接种致病指数（IVPI）为0。剖检发现，部分鸡心包积液、肝脏肿大、十二指肠充血，个别鸡胸腔内有炎性渗出物，其他器官未见明显肉眼病变。咽肛混合拭子病毒分离为阳性，表明这2株毒株都可感染鸡并排毒。

将P347和QY1139鼻腔接种小鼠后，剖检组织均无肉眼可见病理变化。病毒接种3 d后进行病毒分离滴定，在鼻甲和肺中分离到病毒，在其他组织，如脑、肝、脾组织中均未分离到病毒（表2）。

表2 P347和QY1139对鸡和小鼠的致病性

3 讨论

2013年—2016年6月，我国内地共报告发现12例人H9N2病例，其中1人死亡。调查发现有6人发病前有活禽市场或活禽环境暴露史，说明活禽在这些病例的感染中起到了重要作用。野鸟是AIVs的自然储存库，病毒可随其迁徙长距离传播，并可将病毒传播给其他水禽和家禽。

为进一步了解我国野鸟中H9N2亚型禽流感病毒的感染情况，2015—2016年对鄱阳湖和青海湖地区的野鸟进行了监测，共分离到12株病毒。序列分析表明，所有12株病毒的HA裂解位点处仅有2个碱性氨基酸，属于低致病性禽流感病毒。HA受体结合位点分析表明，HA蛋白的第226位大多数为倾向结合人源受体的赖氨酸（L）。受体结合试验也验证了这一点，它们可以同时结合人和禽样受体。为进一步分析其生物学特性，分别选取2株病毒进行了感染和致病性试验。SPF鸡感染试验结果表明，2株病毒的静脉接种指数（IPVI）均为0，为低致病性禽流感病毒，该结果与序列分析结果一致。Balb/c小鼠感染试验结果表明，病毒可在鼻甲和肺等部分组织中限制性增殖，剖检组织中均无肉眼可见病理变化，说明这2株病毒对Balb/c小鼠有一定的感染性，但致病性不强。

野鸟是AIVs的重要传染源[1]，特别是水禽，一直以来都被认为是家禽禽流感疫情的潜在感染源[2]，因此监测野鸟中的AIVs对于理解潜在流行毒株的进化和出现具有重要意义。

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（责任编辑：朱迪国）

Biological Characteristics of H9N2 Subtype Avian Inf l uenza Virus in Wild Birds in Poyang Lake and Qinghai Lake

Jiang Wenming，Hou Guangyu，Peng Cheng，Wang Suchun，Li Jinping，Chen Jiming
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

To investigate the distribution and characteristics of H9N2 subtype avian influenza virus（AIV） in wild birds in China，the surveillance was carried out in Poyang Lake and Qinghai Lake during 2015—2016，and 12 avian inf l uenza viruses of subtype H9N2 were isolated. The HA and NA genes of H9N2 isolates were sequenced，the receptor binding assay was conducted，and the infectivity of the isolates were evaluated in SPF chickens and Balb/c mice. Sequence analysis results showed that there was a HA cleavage site of PSRSSR/GLF in all isolates，a characteristic of low pathogenic avian inf l uenza virus. There were esidues Q226 at the HA receptor binding sites in all isolates，a molecular characteristic of influenza virus receptor associated with human like. The receptor binding assay results showed that all isolates could bind not only avian-like but also human-like receptors. The challenge experiment of SPF chickens showed that all isolates were low pathogenic. The infectious experiments results in mice showed that the isolates were able to be replicated only in the nasal turbinate and lungs of mice，and there were no apparent clinical signs.

avian inf l uenza virus；H9N2；wild birds infectivity

S852.65

：A

：1005-944X（2017）06-0010-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.003

科技部科技基础性工作专项（2012FY111000）