田 康，王 镇，赵焕云，杨 东，李国云，段博芳，张应国，范泉水，李莲军，张文东，张富强

（1.云南农业大学，云南昆明 650223；2.云南省动物疫病预防控制中心，云南昆明 650201；3.迪庆州动物疫病预防控制中心，云南香格里拉 674400；4. 香格里拉市动物疫病预防控制中心，云南香格里拉 674400；5.成都军区疾病预防控制中心，云南昆明 650118）

云南省部分活禽零售市场休市前后禽流感病毒动态监测

田 康1，2，王 镇3，赵焕云2，杨 东4，李国云4，段博芳2，张应国2，范泉水5，李莲军1，张文东2，张富强5

（1.云南农业大学，云南昆明 650223；2.云南省动物疫病预防控制中心，云南昆明 650201；3.迪庆州动物疫病预防控制中心，云南香格里拉 674400；4. 香格里拉市动物疫病预防控制中心，云南香格里拉 674400；5.成都军区疾病预防控制中心，云南昆明 650118）

[目的]监测活禽零售市场休市前后家禽和环境中禽流感病毒的分布和波动状况，评估定期休市干预效果。[方法] 在2015年9月28日至11月11日的3轮休市期间，从云南省选取4个有代表性的活禽零售市场，于休市的前1天、休市当日及休市后1天（复市当日）、3天、5天、10天，采集家禽喉气管、咽喉/泄殖腔棉拭子和环境样品，连续进行3轮采样，采用甲型流感病毒通用型RT-PCR方法，检测样品中的病毒核酸，开展禽流感病毒分布动态监测和休市干预效果评估。[结果]不同市场、不同休市轮次的休市干预效果参差不齐；禽流感病毒在鸡鸭混杂销售的市场中呈现持续分布，而在仅有鸡销售的市场中呈间断或零星分布；鸭群样品阳性率高于环境样品和鸡群样品阳性率。[结论]研究结果提示：鸭群对活禽零售市场的禽流感病毒传入、扩散和持续分布发挥着极其重要的作用；活禽零售市场的休市干预效果受多种因素影响，只有科学规范实施休市制度和严格执行监管措施，才能获得良好的休市干预效果。

禽流感病毒；活禽市场；休市；监测

禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类传染性疾病综合征，部分H5、H7亚型病毒可感染人，甚至可导致多人死亡[1-2]，其不仅给家禽产业造成巨大经济损失，而且严重威胁人类身体健康和公共卫生安全。鉴于活禽交易市场中的家禽及其他动物来源复杂，人员往来及动物流动频繁，陆禽、水禽高密度混杂聚集，卫生条件差，以及病原种类或病毒血清（亚）型、基因型众多，动物长期处于应激状态等原因，病原极易大量复制增殖并在动物群体及环境中持续分布、扩散，再加上动物与动物、人与动物之间的近距离密切接触，活禽交易市场已成为禽流感病毒持续存在的重要场所[1-5]。因此，对活禽交易市场的有效管控，包括实施定期休市消毒制度，有利于降低动物群体及市场环境中的禽流感病毒载量，防止病毒在动物与动物、动物与人之间传播。但由于受多种因素影响，其实施效果存在不确定性[3-5]。2015年9月云南省在部分地区实施了活禽交易市场休市干预措施。为评估休市干预效果，分析可能存在的干扰因素，从云南省选取4个每半月休市1次（天）的，有代表性的活禽零售市场，在3个休市期间，连续采集家禽及环境样品进行禽流感病毒检测，基于休市前后病毒分布和波动动态，进行评估分析。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及病毒对照

病毒R N A/D N A提取试剂盒（Ta K a R a MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0）、TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）、Premix Taq酶、DL2000 DAN Marker，购自宝生物工程（大连）有限公司；氯仿、异丙醇为分析纯试剂；灭活的H5N1、H9N2亚型病毒，购自哈尔滨维科生物技术开发公司，作为检测病毒的阳性对照。

1.2 市场选取和采样时间点设置

在2015年9月28日到11月11日3轮休市期间，从云南省选取鸡鸭同摊位出售（市场1），仅有鸡出售（市场2、市场4），以鸡出售为主、零星有鸭出售（市场3）的4个有代表性的活禽零售市场进行休市效果评估。分别于每轮休市的前1天、休市当天，以及休市后1天（复市当天）、3天、5天、10天（共6个时间点）连续采集样品。

1.3 抽样策略、样品数量及样品采集

采取两段分层随机抽样。第一阶段，按照市场内不同家禽种类的摊位数量，按照50%的摊位预期流行率、30%的可接受绝对误差和95%的置信水平，随机至少选取10个摊位（后两轮的采样摊位与其一致）；第二阶段，根据每个摊位内活禽的存栏量，以发现疫病方式计算样本量，按照每个摊位50%的个体流行率、90%的试验敏感性和95%的置信水平，采集家禽喉气管（优先采集）、咽喉/泄殖腔棉拭子样品（休市当天除外）和环境样品（地面、笼具、食槽、运输工具）10～25份。将喉气管样品直接置于2 mL EP管中，将棉拭子放入预先装有500 µL无菌PBS的EP管中，-20 ℃或更低温度冻存。在3轮休市期间，共采集样品2 500份，其中鸡喉/气管样品1 157份、鸭喉气管样品93份、鸡咽喉/泄殖腔棉拭子142份、鸭咽喉/泄殖腔棉拭子102份、环境样品1 006份。

1.4 样品检测及数据分析

按试剂盒提供的操作手册，从家禽喉气管组织研磨离心上清液、咽喉/泄殖腔或环境棉拭子浸出液中，提取总RNA；参照行业标准《禽流感病毒RT-PCR检测方法》（NY/T 772—2013）及本课题组建立的方法[6]检测禽流感病毒核酸。采用Excel和JMTJFX 10.34软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 休市前后禽流感病毒核酸的检测结果及休市干预效果

不同市场、同一市场不同轮次的休市干预效果参差不齐。如：对市场1第2轮鸡群、市场4第1轮环境及第2轮鸡群（P<0.01）的休市效果明显；对市场1的3个轮次环境、市场2第1、3轮休市前后鸡群（P<0.05）有一定的休市效果；对市场1第1、3轮休市前后鸡群（P>0.05）的休市效果不明显或无效果；对市场2和市场3第2轮鸡群及市场2第1～2轮环境，无法统计分析干预效果（表1）。

存在休市当天对环境消毒不彻底的情况，如在市场1和市场3的第1轮休市当天采集的环境样品中，仍可检测到禽流感病毒核酸和活病毒。

2.2 不同活禽零售市场鸡群中禽流感病毒核酸检测结果及干预效果比较

综合4个市场3轮休市中不同活禽零售市场鸡群样品总体检测结果（图1）发现：禽流感病毒在市场1鸡群中呈现持续分布，在其余市场鸡群中呈现间断或零星分布；休市对市场2和市场4鸡群中的禽流感病毒分布和扩散有一定的干预效果（P<0.05），对其余2个市场的休市干预效果不明显或无效果（P>0.05）。

图1不同市场休市前后鸡群中禽流感病毒核酸检测结果

2.3 不同活禽零售市场环境中禽流感病毒核酸的检测结果及干预效果比较

综合4个市场3轮休市中不同活禽零售市场环境样品总体检测结果（图2）发现：市场1和市场3环境中禽流感病毒呈现持续分布，而市场2和市场4环境中禽流感病毒呈现间断或零星分布；休市对市场1和市场3（第3轮次除外）环境中禽流感病毒感染、分布或扩散有一定的干预效果（P<0.05）或干预效果明显（P<0.01），而对市场2和市场4环境的休市干预效果不明显或无效果（P>0.05）。

表1云南省活禽零售市场休市前后禽流感病毒核酸检测阳性率及干预效果（单位：%）

图2不同市场休市前后环境中禽流感病毒核酸检测结果

2.4 活禽零售市场家禽及环境样品中禽流感病毒的核酸检测结果及干预效果比较

综合活禽零售市场1的3轮休市总体检测结果（图3）发现：禽流感病毒在市场1呈现持续分布；鸭群样品阳性率高于环境样品和鸡群样品阳性率；休市干预除对环境中的病毒感染、分布或扩散有一定抑制效果外（P<0.05），对鸡群和鸭群的效果不明显（P>0.05）。

图3市场1休市前后家禽及环境中禽流感病毒核酸检测结果

综合市场2、市场4的3轮休市结果发现：禽流感病毒在市场2和市场4呈现间断或零星分布；鸡群样品阳性率与环境样品阳性率无相关性和可比性。总体而言，休市干预对鸡群中禽流感病毒感染、分布或扩散有一定或明显的抑制或阻断效果（P<0.05或P<0.01），但对环境中的病毒抑制效果不明显（P>0.05）。

综合市场3的3轮休市结果发现：禽流感病毒在市场3呈现混合分布，在鸡群中以间断或零星分布为主，而在环境中以持续分布为主；鸡群样品阳性率与环境样品阳性率无相关性和可比性。总体而言，干预效果与市场2、市场4相反，而与市场1相似，休市干预对鸡群中禽流感病毒感染、分布或扩散的抑制或阻断效果不明显（P>0.05），但对环境中病毒抑制效果明显（P<0.01）。

3 讨论

3.1 发病家禽和健康带毒家禽及污染的饲料、饮水、饲料槽、运输工具和空气等均可传播禽流感病毒

活禽交易市场，尤其是活禽零售市场，是不同来源、批次和种类活禽的聚集地，加之其场地狭小、卫生条件差，鸡鸭等在此高密度混杂、长时间滞留，人员、车辆往来及家禽流动、交易频繁，因此病毒极易大量复制增殖并在家禽群体及环境中持续传播和扩散，导致活禽零售市场成为禽流感病毒持续存在的高风险区域。此外，病毒的持续分布和扩散加剧了病毒变异（基因突变和基因重配）[7-10]。因此，开展科学有效的活禽交易市场管控，对减少家禽群体和环境中禽流感病毒载量和污染面积，减缓病毒变异速率，控制和阻断病毒在家禽间的传播和扩散，消除和降低人感染禽流感病毒的风险具有重要意义。

3.2 活禽零售市场休市干预的效果受多种因素影响[7-10]

休市前1天，在闭市前，应宰杀市场内未售出的所有活禽，禁止活禽流出市场，并对所有用具和环境进行彻底清洗和消毒。但在市场1、市场3第1轮休市的当天采集的环境样品中仍可检测到病毒核酸，阳性结果已经接种鸡胚分离病毒确认（另文报道），因此存在对环境消毒不彻底的情况。

休市后1天或复市当天，所有进入市场的家禽应来源于经H5、H7、H9亚型流感检疫合格的养殖场或批发市场，因此在其体内检出H5、H7、H9亚型流感活病毒，尤其是H5亚型活病毒的概率应该非常低。但在市场1第1轮、第3轮休市的鸡样品，市场1各轮休市的鸭样品，市场2、市场4第3轮休市和市场4第1轮休市的鸡样品中，均于休市后1天（复市当天）检出禽流感病毒核酸阳性，鸡、鸭阳性率分别为5.00%～32.00%、18.75%～36.36%。对阳性样品经鸡胚接种、病毒分离，确认存在H5、H9亚型活病毒，表明当天进入市场的家禽就已携带病毒。因此，应加强对流入市场家禽的监管和检疫，尽量避免外表健康的隐性感染带毒家禽或免疫带毒家禽进入市场。

每天闭市前，应宰杀市场内未售出的所有活禽，禁止活禽在市场过夜或流出市场，但目前对此缺乏强制性监管。

鸡、鸭等应分离或分市销售[9，11]，但市场1一直存在鸡鸭鹅混杂销售的摊位，市场3零星存在鸡鸭混杂销售，说明对该措施缺乏强制性监管。

优先采集喉气管样品，考虑到与咽喉拭子、泄殖腔拭子样品相比，组织样品中的病毒滴度更高，离体后病毒存活时间更长，有利于提高检测结果的敏感性，但需要宰杀动物，采样成本高。

3.3 水禽对活禽零售市场禽流感病毒的传入、扩散和持续分布发挥着重要作用

检测发现，仅有鸡销售的市场2、市场4，以鸡销售为主、零星有鸭销售的市场3的家禽和环境中，禽流感病毒均呈现间断或零星分布；而在鸡鸭混杂销售的市场1，禽流感病毒在家禽和环境中却呈现持续分布。

在3轮休市样品采集的15个时间点（休市当天除外），市场2、市场3和市场4鸡群样品中，分别有9个（60.00%）、9个（60.00%）和12个（80.00%）时间点，环境样品中分别有13个（86.67%）、7个（46.67%）和12个（80.00%）时间点，未检出禽流感病毒核酸，而在市场1的鸡群、环境中，仅分别在3个（20.00%）、1个（6.67%）时间点，未检出禽流感病毒核酸。监测发现：市场1（有鸡鸭混杂销售）较市场2、市场4（仅有鸡销售）和市场3（以鸡销售为主、零星有鸭销售）的禽流感病毒阳性率高，且病毒呈现持续分布；市场2和市场4对鸡群休市的干预效果较市场1和市场3明显；市场1鸭群样品禽流感病毒阳性率明显高于鸡群样品和环境样品。加之已有研究报道，鸭等水禽感染禽流感病毒后，临床症状不明显但可长时间持续排出活病毒[11-12]。这些均提示鸭群可能对活禽零售市场中禽流感病毒的传入、扩散和持续分布发挥着极其重要的作用。因此，应加强对市场鸭群的检疫，避免鸭群和鸡群混杂聚集，严格实施分离或分市销售。

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（责任编辑：朱迪国）

Dynamic Monitoring of Avian Inf l uenza Virus before and after the Closure of Some Live Poultry Retail Markets in Yunnan Province

Tian Kang1，2，Wang Zhen3，Zhao Huanyun2，Yang Dong4，Li Guoyun4，Duan Bofang2，Zhang Yingguo2，Fan Quanshui5，Li Lianjun1，Zhang Wendong2，Zhang Fuqiang5

（1. Yunnan Agriculture University，Kunming，Yunnan 650223；2. Centre for Animal Disease Control and Prevention of Yunnan Province，Kunming，Yunnan 650201；3. Centre for Animal Disease Control and Prevention of Diqing Municipality，Shangri-La，Yunnan 674400；4. Centre for Animal Disease Control and Prevention of Shangri-La City，Shangri-La，Yunnan 674400；5. Centre for Disease Control and Prevention of Chengdu Military Region，Kunming，Yunnan 650118）

[Objective] To monitor the distribution and fl uctuation of avian inf l uenza virus in poultry and environment before and after the closure of live poultry markets，and to evaluate the effect of regular intervention. [Methods] Samples including poultry larynx and trachea tissues，throat/cloaca and environmental cotton swabs were collected from four representative markets on the fi rst day before closure，the closing day and the fi rst，the third，the fi fth and thetenth day after closure in three consecutive rounds during 28th September to 11th November in 2015. The viral nucleic acids of the samples were detected using inf l uenza type A virus universal RT-PCR for surveillance of avian inf l uenza virus dynamics and evaluation the intervention effect. [Results] The results showed that the effectiveness of closure intervention among the different markets and rounds were uneven or varied. The distribution of avian inf l uenza virus in the chickens and ducks mixed markets was persistent and continuous，but discontinuous or sporadic in the only chicken sales markets. The positive rate of viral nucleic acids in ducks was higher than in chickens or environment. [Conclusion] The results suggested that the duck played a very important role in introduction，transmission，spreading，and continuous distribution of avian inf l uenza virus in live poultry retail markets. The intervention effectiveness of market closure were inf l uenced or disturbed by many factors. To obtain good intervention effect，the regulations of market closure and supervision should be implemented scientif i cally，standardly and strictly.

avian inf l uenza virus；live poultry market；market closure；surveillance

S852.65+9.5

：A

：1005-944X（2017）06-0001-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.001

国家公益性行业专项（201103008）；军队科技计划项目（BWS14J025）

并列第一作者：田 康、王 镇

张文东、张富强